正天丸的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究*

付 昆,付文君, 魏江平, 鄭 航, 吳 倩,孟 詩, 劉慧蘭,徐世軍△

(1. 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075；3. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，成都市第三人民醫(yī)院，成都 610031；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

正天丸的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究*

付 昆1,2,3,付文君1,2, 魏江平1,2, 鄭 航1,2, 吳 倩1,2,孟 詩1,2, 劉慧蘭4△,徐世軍1,2△

(1. 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075；3. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，成都市第三人民醫(yī)院，成都 610031；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

目的：考察正天丸鎮(zhèn)痛作用以及鎮(zhèn)痛機(jī)制，為其治療偏頭痛提供藥理學(xué)依據(jù)。 方法：小鼠連續(xù)預(yù)給藥5 d，采用熱板、冰乙酸、甲醛3個(gè)經(jīng)典疼痛動(dòng)物模型觀察正天丸對(duì)疼痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用；采用紫外分光光度法測定甲醛疼痛模型各組小鼠血清中前列腺素E2(PGE2)和腦組織中谷氨酸(Glu)含量，硝酸還原酶法測定血清中一氧化氮(NO)含量以及ELISA法檢測腦中降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)含量，探討其鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制。 結(jié)果：正天丸能提高熱刺激小鼠的痛閾值，延長冰乙酸所致的小鼠扭體反應(yīng)潛伏期，減少扭體次數(shù)，并能顯著縮短甲醛致痛小鼠的Ⅰ相和Ⅱ相舔、咬足時(shí)間；明顯降低甲醛致疼痛模型小鼠血清PGE2、腦組織Glu和CGRP含量，顯著提高外周血清NO含量。 結(jié)論：正天丸具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛機(jī)制與抑制中樞Glu、CGRP釋放、降低外周疼痛介質(zhì)PGE2含量、促進(jìn)外周NO合成有關(guān)。

正天丸；鎮(zhèn)痛；一氧化氮；前列腺素E2；谷氨酸；降鈣素基因相關(guān)肽

偏頭痛是一種以反復(fù)出現(xiàn)單側(cè)頭痛為特征的慢性神經(jīng)血管疾病，除了疼痛以外還常伴隨其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如惡心、畏光、畏聲、氣味恐懼、疲倦以及自律、精神、感覺和運(yùn)動(dòng)功能紊亂[1]。偏頭痛發(fā)作時(shí)產(chǎn)生劇烈的疼痛是所有癥狀中最主要的病癥[2]，也是影響患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵所在。研究表明，反復(fù)或者高強(qiáng)度的有害刺激會(huì)導(dǎo)致Aδ和C纖維的傷害感受器敏化，其激活的閾值降低(即痛覺敏化)[3]，釋放興奮性氨基酸(谷氨酸，Glu)和神經(jīng)肽(如P物質(zhì)和CGRP)等神經(jīng)遞質(zhì)，激活感覺神經(jīng)元，將沖動(dòng)通過神經(jīng)纖維傳導(dǎo)至大腦產(chǎn)生痛覺。外周和中樞痛覺敏化正是偏頭痛的病理基礎(chǔ)[4]，是導(dǎo)致痛覺出現(xiàn)的核心機(jī)制。正天丸(zhengtian pill，ZTP)作為臨床治療偏頭痛的常用中成藥，探討其鎮(zhèn)痛作用可為該藥治療偏頭痛提供進(jìn)一步的藥理學(xué)依據(jù)，然而迄今尚未見有關(guān)該藥針對(duì)疼痛本身的作用和機(jī)制的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量16～22 g，雌雄兼用，成都達(dá)碩生物科技有限公司提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(川)2013-24)。國家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房室溫20～26 ℃，明暗12 h/12 h交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲水和進(jìn)食。

1.1.2 藥物與試劑 正天丸(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1501034H)，阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)BJ23036)，鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號(hào)150409-1，臨用前用生理鹽水稀釋成0.1%的嗎啡溶液)，NO含量測試盒(批號(hào)20160707)，谷氨酸測試盒(批號(hào)20160718)，考馬斯亮藍(lán)蛋白測試盒(批號(hào)20160712)，小鼠CGRP酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)20160721)均購自南京建成生物工程研究所，甲醛、冰乙酸、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、氫氧化鉀、甲醇均為分析純(成都科龍化工試劑廠)，試驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.1.3 主要儀器 電子分析天平(FA1204L，上海越平科學(xué)儀器有限公司)，電熱恒溫水溫箱(HH·WZ1·420S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，智能熱板儀(RB-200，成都泰盟科技有限公司)，湘儀離心機(jī)(TDZ5-WS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，酶標(biāo)儀(3001，Thermo Scientific)，紫外-可見分光光度儀(UV2600，天美(中國)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 ZTP鎮(zhèn)痛作用研究

(1)ZTP對(duì)乙酸致痛模型的影響——扭體法：40只小鼠雌雄各半，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為CMC對(duì)照，ZTP高、中、低劑量及阿司匹林對(duì)照5組各8只。按照表1劑量ZTP用0.5%CMC-Na溶液混懸灌胃，CMC對(duì)照組給予0.03 ml·g-1CMC-Na溶液，連續(xù)給藥5 d。末次給藥60 min后，各組小鼠均腹腔注射0.7%冰乙酸0.2 ml/只，觀察并記錄小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間(扭體潛伏期)以及15 min內(nèi)發(fā)生扭體反應(yīng)的次數(shù)，并依照抑制率(%)=(CMC組平均扭體次數(shù)-藥物組平均扭體次數(shù))/CMC組平均扭體次數(shù)×100%計(jì)算藥物對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的抑制率。

(2)ZTP對(duì)熱刺激致痛模型的影響——熱板法：選用雌性小鼠放于(55±0.5)℃熱板儀上，以小鼠出現(xiàn)舔后足的時(shí)間(痛閾值)作為痛反應(yīng)指標(biāo)篩選痛閾值5～30 s者為合格鼠，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為CMC、ZTP高、中、低劑量組和嗎啡組5組各8只。實(shí)驗(yàn)前測定各組小鼠給藥前痛閾值，測2次取平均值，每次測量間隔不少于5 min。CMC對(duì)照組及ZTP各劑量組同(1)項(xiàng)灌胃給藥。嗎啡組只給藥1次，于實(shí)驗(yàn)前30 min腹腔注射0.1%嗎啡0.01 ml·g-1。末次給藥后于30、60、90、120 min分別測定各組小鼠痛閾值。為防止動(dòng)物燙傷，超過60 s仍不出現(xiàn)痛反應(yīng)者，應(yīng)從熱板儀取出，痛閾值計(jì)為60 s。

(3)ZTP對(duì)甲醛致痛模型的影響——福爾馬林實(shí)驗(yàn)：40只小鼠，雌雄各半，與(2)項(xiàng)分組及給藥。嗎啡組給藥30 min后，其余各組末次灌胃60 min后，分別于小鼠右后足底皮下注射5%甲醛溶液20μL/只，立即置于2000 ml燒杯中，觀察并記錄0～5 min(Ⅰ相，早發(fā)相)和10～30 min(Ⅱ相，遲發(fā)相)2個(gè)時(shí)相小鼠舔、咬右后足的累計(jì)時(shí)間。計(jì)算藥物對(duì)甲醛致痛反應(yīng)的抑制率，抑制率(%)=(CMC對(duì)照組舔足時(shí)間-給藥組舔足時(shí)間)/CMC對(duì)照組舔足時(shí)間×100%。

觀察結(jié)束后，摘除小鼠眼球取血，3500 rpm離心10 min，分離血清，-20℃保存待測。然后脫臼處死冰上取腦，生理鹽水漂洗、濾紙拭干，-70℃保存待測。

1.2.2 ZTP鎮(zhèn)痛作用機(jī)制研究 取(3)項(xiàng)下小鼠血清100μL加入0.5mol/L的KOH-CH3OH溶液2ml，置于(50±0.5)℃水浴箱中異構(gòu)化20 min，再加甲醇2.5 ml，離心2500rpm×10 min，取上清于紫外分光光度儀278nm處測定吸光度(A)值[5]。以PGE2吸光度值表示PGE2含量。另取血清100μL，按試劑盒說明測定血清中NO含量。取出凍存腦組織準(zhǔn)確稱重，按1∶9加入9倍體積的生理鹽水，冰浴條件下勻漿，3500rpm×10 min離心，取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，檢測腦Glu、CGRP含量。

2 結(jié)果

2.1 ZTP對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響

表1顯示，ZTP各劑量組均能不同程度地延長小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期和減少15 min內(nèi)扭體的次數(shù)，但與溶劑CMC組比較，中、高劑量組扭體潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中、高劑量組對(duì)小鼠扭體次數(shù)的抑制更明顯(P≤0.01)，抑制率分別可達(dá)42.07%和49.52%，而低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 ZTP對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的作用±s)

注：與CMC對(duì)照組比較：*P≤0.05，**P≤0.01(表2～4同)

2.2 ZTP對(duì)熱刺激小鼠痛閾的影響

表2顯示，ZTP在給藥1 h后起效，能一定程度延長60、90、120 min各時(shí)間點(diǎn)熱刺激所致小鼠痛反應(yīng)的潛伏期，提高小鼠的痛閾值，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)可持續(xù)到2 h，中、高劑量組與CMC對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，其鎮(zhèn)痛作用弱于嗎啡。

表2 ZTP對(duì)熱板實(shí)驗(yàn)小鼠痛反應(yīng)潛伏期的影響±s)

2.3 ZTP對(duì)甲醛致痛模型小鼠2個(gè)時(shí)相痛反應(yīng)的影響

甲醛溶液足底皮下注射給藥后，會(huì)誘發(fā)小鼠出現(xiàn)早發(fā)相(即Ⅰ相，0～5 min)和遲發(fā)相(Ⅱ相，10 min以上)2個(gè)時(shí)相舔、咬注射足的痛反應(yīng)。表3顯示，ZTP對(duì)Ⅰ、Ⅱ相小鼠痛反應(yīng)均有抑制作用，小鼠Ⅰ、Ⅱ相舔、咬足時(shí)間明顯下降，與CMC對(duì)照組比較，中、高劑量抑制更明顯(P≤0.05)，但鎮(zhèn)痛效果略弱于嗎啡。

表3 ZTP對(duì)甲醛致痛小鼠Ⅰ、Ⅱ相痛反應(yīng)時(shí)間的影響±s)

2.4 ZTP對(duì)甲醛模型小鼠血清及腦組織中疼痛因子的影響

表4顯示，ZTP各劑量組均能有效降低甲醛疼痛小鼠外周血清PGE2含量，與CMC組比較(P≤0.01或P≤0.05)；ZTP中、高劑量則顯著升高血清中NO含量(P≤0.01)；對(duì)于中樞腦內(nèi)遞質(zhì)Glu，ZTP有明顯抑制作用，高、中、低劑量均有效(P≤0.01)；且ZTP亦能降低小鼠腦內(nèi)CGRP含量，高劑量效果更顯著(P≤0.01)。

表4 ZTP對(duì)甲醛模型小鼠各疼痛因子水平的影響±s)

3 討論

偏頭痛是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但發(fā)病機(jī)理尚不明確。目前最主流的三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說將偏頭痛歸結(jié)于血管活性肽誘導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥、顱內(nèi)外血管擴(kuò)張和中樞疼痛傳遞內(nèi)源性抑制減少綜合作用的結(jié)果[6]。偏頭痛發(fā)作時(shí)，刺激三叉神經(jīng)纖維(包括C和Aδ纖維)誘發(fā)CGRP和其他血管活性物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致硬腦膜和外周組織神經(jīng)源性炎癥[7]?？梢娚窠?jīng)源性炎癥是偏頭痛重要的病理進(jìn)程，神經(jīng)性炎性痛是其主要的病癥表現(xiàn)。

中醫(yī)理論認(rèn)為，肝臟功能失調(diào)可以引起頭痛。如《脈經(jīng)·頭痛》認(rèn)為:“足厥陰與少陽氣逆，則頭目痛?！逼^痛患者除頭痛外，情緒異常亦為重要表現(xiàn)，常見煩躁、恐懼及發(fā)急、悲觀失望等，說明本病與肝失疏泄、不能正常調(diào)節(jié)情志有關(guān)[8]。這與前文提到的偏頭痛常伴隨的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂不謀而合。肝失疏泄則氣機(jī)失常，氣機(jī)逆亂，壅遏絡(luò)脈?！蹲C治準(zhǔn)繩》曰：“病頭痛者，凡此皆臟腑經(jīng)脈之氣逆上，逆亂于頭之清道，致其不得運(yùn)行，壅遏精髓而痛者也。[9]”頭痛是偏頭痛臨床最主要的癥狀和體征，有效緩解疼痛是治療的主要目的。ZTP具有通絡(luò)止痛的功效，因而研究其鎮(zhèn)痛作用可為其治療偏頭痛提供進(jìn)一步的藥理學(xué)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，ZTP對(duì)熱板、乙酸、甲醛誘發(fā)的疼痛反應(yīng)均有不同程度的抑制作用，說明其鎮(zhèn)痛作用確切。其中熱板法是以熱刺激產(chǎn)生急性痛，常用于評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛藥的中樞作用，而扭體法誘發(fā)的炎性痛常作為外周炎性疼痛模型，提示ZTP既可能有中樞作用也有外周作用。而甲醛模型引發(fā)了2個(gè)時(shí)相反應(yīng)，Ⅰ相是直接刺激C纖維傷害感受器，造成神經(jīng)傷害誘導(dǎo)神經(jīng)性痛[10]，Ⅱ相則是外周組織炎癥和中樞敏化綜合作用出現(xiàn)的持續(xù)炎性痛反應(yīng)[11]，因而是較好的慢性疼痛模型，與偏頭痛的疼痛類型有較高的契合度。ZTP對(duì)上述3個(gè)疼痛模型均有鎮(zhèn)痛作用，尤其中、高劑量能較明顯地抑制乙酸扭體反應(yīng)和甲醛引發(fā)的Ⅰ、Ⅱ相反應(yīng)，顯示出對(duì)神經(jīng)炎性疼痛的鎮(zhèn)痛活性，因此佐證了ZTP對(duì)偏頭痛的治療作用。

甲醛作為疼痛刺激物質(zhì)，外周組織受到其傷害性刺激促使初級(jí)傳入神經(jīng)元和背角神經(jīng)元釋放，諸如Glu、P物質(zhì)、CGRP的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[12]。隨后Glu激活其離子型受體NMDA離子通道，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，引起酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激前列腺素(包括PGE2)的釋放[13]。PGE2既是炎癥介質(zhì)又是致痛因子，炎癥組織PGE2的增加可引起痛覺過敏和痛覺超敏的發(fā)生[14]。釋放的Glu亦可通過誘導(dǎo)脊髓背角神經(jīng)元突觸可塑性而使痛覺敏化[15]。CGRP則參與調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)源性炎癥和痛覺傳入[16]。ZTP干預(yù)后，甲醛模型小鼠腦Glu、CGRP和血清PGE2水平均明顯下降，提示ZTP不僅可以通過抑制中樞部位Glu、CGRP的釋放，而且可以抑制外周疼痛介質(zhì)PGE2的合成，從而抑制中樞和外周痛覺敏化，達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。

NO是一種氣體信號(hào)分子，能雙向調(diào)節(jié)痛覺，既可致痛又可鎮(zhèn)痛[17]。這種雙重作用具體以何種效應(yīng)體現(xiàn)依賴于病理進(jìn)程所處階段[18]、疼痛模型[19]、給藥途徑[20]以及NO供體(前體)或抑制劑的劑量[21]。本次實(shí)驗(yàn)條件下，ZTP和嗎啡能顯著增加甲醛模型小鼠外周血中NO濃度，提示ZTP可能通過促進(jìn)外周水平的NO釋放而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)NO濃度升高也會(huì)增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛效果[22]。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[11,23-24]中NO調(diào)控疼痛的報(bào)道是一致的，但與偏頭痛病理過程中NO的作用并不一致，我們推測可能與二者的疼痛模型不同有關(guān)。

綜上可知，正天丸鎮(zhèn)痛作用較明確，其鎮(zhèn)痛部位既可能位于中樞也可能在外周，作用機(jī)制可能與抑制中樞Glu、CGRP的釋放、降低外周PGE2含量并促進(jìn)外周NO合成、抑制痛覺敏化有關(guān)。

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Effect and molecular mechanisms of Zhengtian Pill on antinociception

FU Kun1,2,3，F(xiàn)U Wen-jun1,2，WEI Jiang-ping1,2，ZHENG Hang1,2, WU Qian1,2，MENG Shi1,2，LIU Hui-lan4△，XU Shi-jun1,2△

(1.SichuanProvincialStateKeyLabBreedingBaseofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResources,Chengdu611137，China；2.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China； 3.The3rdPeople’sHospitalofChengdu，2ndAffiliatedChengduClinicalCollegeofChongqingMedicalUniversity，Chengdu610031，China；4.The3rdAffiliatedHospital，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China)

Objective: To investigate the analgesic effect and molecular mechanisms of Zhengtian Pill (ZTP) to provide the pharmacological evidence of migraine therapy. Methods: The hot plate test, acetic acid-induced writhing test and formalin test were used to assess the analgesic effect of ZTP after administration for 5 days. After the formalin test, Prostaglandin E2(PGE2) and nitric oxide (NO) in mice serum, glutamate (Glu) and calcitonin gene related peptide (CGRP) in mice brain were measured by Ultraviolet spectrophotometry, Nitrate reductase approach and ELISA kits, respectively, to analyze their changes in content via the intervention of ZTP. Results: ZTP elevated pain threshold to thermal stimuli, also prolonged latency time to writhing reaction and decreased number of writhing in acetic acid test in mice. Furthermore, ZTP significantly reduced total time of licking, biting the injected paw in the biphasic responses induced by formalin in mice. Meanwhile, ZTP markedly reduced content of PGE2in mice serum, Glu and CGRP in mice brain, whereas ZTP increased NO level in peripheral mice serum. Conclusions: ZTP can exert analgesic effect on nociception induced by thermal, acetic acid and formalin stimuli. These molecular mechanisms involve not only in inhibition of release of central Glu, CGRP and peripheral PGE2, but also in promotion of synthesis of peripheral NO.

Zhengtian Pill; analgesia; NO; PGE2; Glu; CGRP

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81303082)-正天丸干預(yù)血管活性物質(zhì)所致偏頭痛的機(jī)制研究

付 昆，男，四川簡陽人，主管藥師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)研究。

△通訊作者：劉慧蘭，女，副主任醫(yī)師，從事中醫(yī)的基礎(chǔ)與臨床研究，Tel：010-52074242，E-mail：liuhlbj@163.com；徐世軍，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)研究，Tel:028-61800231，E-mail：docxu@126.com。

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1006-3250(2017)03-0401-04

2016-08-23