宋潔，洪海

(1第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院預(yù)防保健科，重慶 400038；2北京鄭常莊離職干部休養(yǎng)所衛(wèi)生所，北京 100141)

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌在細(xì)胞外多聚物包裹中形成的具有立體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群落，生物膜內(nèi)的細(xì)菌可在信號(hào)分子的調(diào)控下分工協(xié)作，使生物膜內(nèi)的細(xì)菌具有與高等細(xì)胞相似的功能[1,2]。細(xì)菌形成生物膜后可使其抗藥性成百上千倍增高，且在多糖等保護(hù)下可逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，導(dǎo)致感染治療的失敗，這已成為抗感染領(lǐng)域的難題，臨床上85%的感染都和細(xì)菌生物膜相關(guān)[3]。

pH是肺部?jī)?nèi)環(huán)境的一個(gè)重要影響因素，人體氣道表面液體和肺泡液體pH值為6.6～6.9[4]。在疾病過(guò)程中，由于肺組織感染及呼吸性酸堿中毒等疾病的影響，患者呼吸道內(nèi)的pH值可隨病情有所改變，從而影響細(xì)菌的清除和抗菌藥物的活性[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染時(shí)由于細(xì)菌代謝等因素，感染局部組織呈酸性。肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的常見(jiàn)病原菌，我們對(duì)pH值酸性條件下肺炎克雷伯菌的抗藥性及生物膜形成能力的變化進(jìn)行研究，以期為臨床醫(yī)師提供用藥指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

12株肺炎克雷伯菌(K1-K12)均分離自第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院預(yù)防保健科呼吸科住院患者的痰液標(biāo)本。

1.2 試劑與設(shè)備

抗菌藥物左氧氟沙星、慶大霉素和頭孢他啶購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。結(jié)晶紫購(gòu)自Sigma公司，冰醋酸購(gòu)自重慶川東化工有限公司。血瓊脂平板購(gòu)自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司，MH和LB培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司，96孔板購(gòu)自美國(guó)康寧公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司。

1.3 方法

1.3.1 不同pH值條件下最低抑菌濃度的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定不同pH值環(huán)境下抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。肺炎克雷伯菌劃線接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取細(xì)菌單菌落接種于10 ml MH培養(yǎng)基中，37℃、200轉(zhuǎn)/ min培養(yǎng)18 h。用無(wú)菌生理鹽水稀釋校正菌液至0.5麥?zhǔn)蠁挝?約108 CFU/ml)，然后分別用不同pH值(5.5、6.5和7.5)的MH培養(yǎng)基稀釋1000倍。抗菌藥物分別用pH值為5.5、6.5和7.5的MH培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋。然后在96孔板中每孔加入100 μl菌液和100 μl不同濃度的抗菌藥物溶液，使藥物終濃度分別為256和0.125 μg/ml。37℃孵育18 h后判斷結(jié)果，以能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。

1.3.2 不同pH值對(duì)黏附能力的影響 黏附能力檢測(cè)采用菌落計(jì)數(shù)法[6]。將肺炎克雷伯菌過(guò)夜培養(yǎng)物用無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬儆貌煌琾H值(5.5、6.5和7.5)的LB培養(yǎng)基稀釋100倍。在CLSM培養(yǎng)皿中加入2 ml稀釋菌液。37℃孵育4 h后，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)輕柔沖洗2次，去除浮游菌。然后在培養(yǎng)皿中加入PBS超聲10 min使黏附的細(xì)胞脫落。最后將細(xì)胞懸浮液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，取100 μl菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng) 24 h 后計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 不同pH值對(duì)生物膜形成能力的影響 生物膜形成能力檢測(cè)采用96孔板結(jié)晶紫染色法[7]。將肺炎克雷伯菌過(guò)夜培養(yǎng)物用無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.5 麥?zhǔn)蠁挝?，再用不同pH值(5.5、6.5和7.5)的LB培養(yǎng)基稀釋100倍。然后每孔分別加入200 μl菌液，37℃孵育24 h。小心去除浮游菌，PBS輕柔沖洗兩次，倒置風(fēng)干固定。然后加入1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，用流水沖洗3次，再次倒置風(fēng)干。最后每孔加入100 μl 30 %冰醋酸溶液，用酶標(biāo)儀在590 nm處測(cè)定吸光度值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌的MIC

頭孢他啶對(duì)12株肺炎克雷伯菌的MIC值隨著pH值升高而逐漸增加；隨著pH值升高，左氧氟沙星對(duì)肺炎克雷伯菌的MIC值降低；慶大霉素對(duì)肺炎克雷伯菌的MIC值與pH變化沒(méi)有明顯相關(guān)性(表1)。

2.2 不同pH值對(duì)肺炎克雷伯菌黏附能力的影響

隨著pH值升高，肺炎克雷伯菌黏附能力增強(qiáng)。兩獨(dú)立樣本比較結(jié)果顯示，與pH 5.5相比，pH 6.5條件下有6株菌黏附細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，而pH 7.5條件下所有(12株)菌株黏附細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)。多獨(dú)立樣本比較結(jié)果顯示，pH 6.5組肺炎克雷伯菌黏附能力與pH 5.5組細(xì)菌黏附能力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，且pH 7.5組細(xì)菌黏附能力與pH 5.5組差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表2)。

2.3 不同pH值對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的影響

隨著pH值升高，肺炎克雷伯菌生物膜形成能力均有不同程度的增強(qiáng)。兩獨(dú)立樣本比較結(jié)果顯示，與pH 5.5相比，pH 6.5條件下有8株細(xì)菌的生物膜形成能力顯著增高(P<0.05)，而pH 7.5條件下所有(12株)細(xì)菌的生物膜形成能力均顯著增高(P<0.05)。多獨(dú)立樣本比較結(jié)果顯示，與pH 5.5組相比，pH 6.5組和pH 7.5組肺炎克雷伯菌生物膜形成能力均顯著增高(P<0.01；圖1)。

表1 不同pH值條件下抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌的MICTable 1 MIC for antimicrobial agents to Klebsiella pneumonia in different pH conditions (μg/ml)

MIC: minimal inhibitory concentration

Strain pH5．5pH6．5pH7．5K12．29±0．132．61±0．11?2．91±0．15??K22．80±0．153．06±0．143．31±0．15?K31．75±0．071．87±0．071．99±0．11?K41．13±0．081．19±0．101．44±0．09?K51．64±0．081．97±0．08??2．18±0．12??K61．46±0．121．71±0．08?1．90±0．14?K72．13±0．072．31±0．092．58±0．13??K83．68±0．123．81±0．094．18±0．17?K91．96±0．112．22±0．10?2．47±0．11??K102．66±0．113．05±0．08??3．29±0．13??K111．81±0．092．04±0．08?2．25±0．09??K122．22±0．072．40±0．102．57±0．14?

Compared with pH 5.5,*P<0.05,**P<0.01

圖1 不同pH值對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的影響Figure 1 Effect of different pH values on the biofilm formation of Klebsiella pneumonia isolates Compared with pH 5.5, *P<0.05, **P<0.01

3 討 論

肺炎克雷伯菌屬于革蘭氏陰性菌，是人類(lèi)呼吸道的常寄居，在機(jī)體免疫力低下的患者中可引起呼吸道部位的感染[8]，是典型的條件致病菌。隨著臨床上廣譜抗菌藥物的大量應(yīng)用，由該菌引起的醫(yī)院感染和耐藥率呈上升趨勢(shì)[8,9]，特別是肺炎克雷伯菌多重耐藥和生物膜的產(chǎn)生給臨床抗感染治療帶來(lái)了巨大困難。本研究對(duì)不同pH值條件下3種抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌MIC的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，酸性pH條件下，頭孢他啶可以降低肺炎克雷伯菌的MIC值，而左氧氟沙星則增加細(xì)菌的MIC值。有研究表明堿性條件下喹諾酮類(lèi)藥物可以降低奇異變形桿菌的MIC值[10]，提示在相同pH條件下喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)不同細(xì)菌都具有類(lèi)似的作用效果。

細(xì)菌生物膜的形成包括初始黏附和生物膜的形成，其中黏附是評(píng)價(jià)細(xì)菌生物膜形成能力的重要指標(biāo)[11,12]。在體外，細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生依賴(lài)于各種物理和化學(xué)因素，例如培養(yǎng)基的組成、溫度、pH、氧等[13-15]。本研究考察了不同pH值對(duì)肺炎克雷伯菌黏附性和生物膜形成能力的影響，結(jié)果顯示，隨著pH值增加，肺炎克雷伯菌黏附細(xì)胞數(shù)和生物膜形成能力均有不同程度的增加。本研究結(jié)果顯示，pH 6.5組和pH 7.5組肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與pH 5.5組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而這兩組細(xì)菌黏附性與pH 5.5組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究細(xì)菌樣本量少有關(guān)。關(guān)于銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌，也有培養(yǎng)基pH與生物膜產(chǎn)生能力之間成正比關(guān)系的類(lèi)似報(bào)道[13,14]。研究表明，堿性環(huán)境下細(xì)菌生物膜形成能力大于酸性的原因在于產(chǎn)生了較高的藻酸鹽，因?yàn)樵趬A性pH條件下細(xì)菌細(xì)胞壁外膜孔蛋白的擴(kuò)大促進(jìn)碳的累積，進(jìn)而使得藻酸鹽的合成增加[16]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，不同pH環(huán)境可以改變肺炎克雷伯菌的藥物敏感性和生物膜形成能力，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物頭孢他啶在酸性pH條件下具有較好的抗菌活性。提示臨床醫(yī)師應(yīng)根據(jù)患者內(nèi)部環(huán)境pH的變化選擇抗菌藥物。本研究局限性在于只選擇了β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)中的一種藥物進(jìn)行研究，對(duì)于這3類(lèi)中的其他抗菌藥物是否具有相同作用效果以及其他類(lèi)別抗生素的作用均有待于進(jìn)一步研究。

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