注射式脫鈣骨基質(zhì)修復(fù)大鼠顱骨缺損的研究

李矛 沈亞俊 趙彥濤 侯樹勛

注射式脫鈣骨基質(zhì)修復(fù)大鼠顱骨缺損的研究

李矛 沈亞俊 趙彥濤 侯樹勛

目的通過改良脫鈣方法制備注射式脫鈣骨基質(zhì) ( demineralized bone matrix，DBM )，對其理化性質(zhì)和修復(fù)骨缺損能力進(jìn)行觀察評估。方法 采用改良的動態(tài)脫鈣和二次換酸等工藝制備 DBM，通過掃描電鏡對其表面形貌進(jìn)行觀察，連續(xù)光源原子吸收光譜儀測定鈣含量，利用賦形劑將 DBM 顆粒制備成可注射式 DBM。在大鼠顱骨缺損模型中，分別植入傳統(tǒng)方法制備的注射式 DBM 1 和改良方法制備的 DBM 2，并設(shè)定空白對照組。在術(shù)后 4 周和 8 周分別將大鼠顱骨取材，通過 Micro-CT 影像學(xué)檢查以及組織病理切片來觀察顱骨缺損部位骨修復(fù)情況，對新生骨進(jìn)行定量比較。結(jié)果 改良脫鈣的 DBM 2 與傳統(tǒng)方法制備的 DBM 1 相比，其表面形貌無明顯改變，鈣含量百分比均明顯低于行業(yè)要求的標(biāo)準(zhǔn)值。術(shù)后 4 周和 8 周的 Micro-CT 提示：DBM 2 組新骨形成量為 ( 4.6±0.8 ) mm3和 ( 7.6±1.4 ) mm3，百分比為 ( 30.5±5.3 ) % 和 ( 51.4±9.5 ) %；DBM 1組新骨形成體積為 ( 3.6±0.6 ) mm3和 ( 6.2±0.9 ) mm3，百分比為 ( 23.8±4.0 ) % 和 ( 41.9±6.1 ) %；空白組新骨形成體積為 ( 1.3±0.4 ) mm3和 ( 2.1±0.8 ) mm3，百分比為 ( 8.6±2.6 ) % 和 ( 14.2±5.4 ) %，DBM 2 組明顯優(yōu)于DBM 1 組和空白組 ( P＜0.05 )。術(shù)后 8 周的 HE 染色提示：DBM 2 組中新生骨的形成量明顯多于 DBM 1 組和空白組。結(jié)論 利用動態(tài)脫鈣等改良工藝制備的注射用 DBM 2 較傳統(tǒng)方法制備的 DBM 1，更有利于修復(fù)骨缺損，工藝耗時短，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

脫鈣技術(shù)；大鼠；顱骨；脫鈣骨基質(zhì)

由創(chuàng)傷、腫瘤術(shù)后、感染等因素導(dǎo)致的骨缺損，會進(jìn)一步引起肢體的功能障礙，影響患者的生活質(zhì)量，長時間的反復(fù)治療也增加了患者的經(jīng)濟(jì)和時間成本。解決這一難題的主要治療方法是進(jìn)行骨移植促進(jìn)骨修復(fù)再生，其中自體骨移植是金標(biāo)準(zhǔn)。但由于自體取骨數(shù)量有限且易發(fā)生供區(qū)術(shù)后疼痛等并發(fā)癥，其臨床應(yīng)用受到限制[1-3]。同種異體骨來源豐富，不受形態(tài)、大小限制，因而需求量日益增大，其研究和應(yīng)用也日趨活躍，并大量應(yīng)用于臨床[4-5]。骨庫常采用松質(zhì)骨制備同種異體植骨材料而皮質(zhì)骨材料不能被很好地利用，為了解決皮質(zhì)骨的利用問題，本課題組一直進(jìn)行相關(guān)研究和工藝改進(jìn)。同種異體皮質(zhì)骨通過脫鈣處理，可以解除鈣對骨形態(tài)發(fā)生蛋白 ( bone morphogenetic protein，BMP )及其它成骨因子的包繞，更有利于誘導(dǎo)骨形成，其臨床應(yīng)用效果接近凍干松質(zhì)骨的骨愈合率[6]。在DBM 制備過程中，脫鈣是關(guān)鍵[7]，傳統(tǒng)脫鈣對皮質(zhì)骨的酸處理以及去酸處理的時間長，容易導(dǎo)致蛋白活性的損失，影響 DBM 的骨誘導(dǎo)活性[8]。本課題組采取動態(tài)的脫鈣和二次酸處理脫鈣，利用離心機(jī)快速清洗脫酸等一系列工藝處理，制備 DBM ( 北京鑫康辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司提供 )，可以明顯縮短工藝流程時間[9-10]。本研究擬對改良脫鈣方法制備DBM 的骨修復(fù)能力進(jìn)行評估，為臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、兩種方法制備 DBM

嚴(yán)格篩選的供體經(jīng)過 4 周的深低溫處理、解凍，去除軟組織，切割成利于加工的小塊，超聲清洗脫脂，冷凍干燥 72 h。加入粉碎機(jī)中，篩選出150～700 μm 粒徑的顆粒，利用不同方法制備 DBM。本課題組前期通過傳統(tǒng)方法和改良方法分別制備出DBM 1 ( 傳統(tǒng)方法 ) 和 DBM 2 ( 改良方法 )[9]。

其中傳統(tǒng)方法采用 0.5 mol / L 的鹽酸溶液，按稀鹽酸與骨質(zhì)重量比 40∶1 的比例靜止條件下進(jìn)行脫鈣，脫鈣后 3 天，進(jìn)行 5 次超聲水浴清洗，每次1 h，共需 5 h。清洗后需小心棄去上清，防止過多DBM 流失，將收集的 DBM 裝入滅菌袋中，展平放入 -20 ℃ 冰箱預(yù)凍，-40 ℃，＜0.01 kPa ( 1 mm Hg＝0.133 kPa ) 真空條件下冷凍干燥 72 h。聚乙烯塑料袋分裝，3 層密封，60Co 輻照滅菌，劑量 25 kGy。

改良方法按稀鹽酸與骨質(zhì)重量比 20∶1 的比例，加入容器內(nèi)置于恒溫振蕩器上，25 ℃ 條件下20 r / min 的速度進(jìn)行脫鈣反應(yīng)后 1 h 重新?lián)Q酸繼續(xù)振蕩，再經(jīng)過 1 h 的反應(yīng)后，用 20 倍體積水在1000 r / min 的離心速度下漂洗 15 min，棄去上清，重新加水離心重復(fù) 5 次共 75 min。清洗后即刻將DBM 裝入滅菌袋中，展平放入 -20 ℃ 冰箱預(yù)凍，準(zhǔn)備上凍干機(jī)。-40 ℃，＜0.01 kPa 真空條件下冷凍干燥 72 h。聚乙烯塑料袋分裝，3 層密封，60Co 輻照滅菌，劑量 25 kGy。

二、DBM 掃描電鏡觀察及元素分析

將通過傳統(tǒng)脫鈣和改良脫鈣方法制備的 DBM 1和 DBM 2 分別干燥，噴金，掃描電鏡觀察其表面形貌。分別取 DBM 1 和 DBM 2 樣品，使用 MOS ( metaloxide-semiconductor ) 級的硝酸和鹽酸混合溶液 ( 按1∶1 體積配制 ) 溶解，隨后取出測定溶液，利用連續(xù)光源原子吸收光譜儀測定鈣離子質(zhì)量，并計算鈣含量百分比。

三、大鼠顱骨缺損模型的建立及應(yīng)用

動物實(shí)驗(yàn)選取 30 只成年 ( 10～12 周，300～350 g ) 雄性 SD 大鼠 ( 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院動物中心提供并飼養(yǎng) )，所有實(shí)驗(yàn)動物均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，所有動物實(shí)驗(yàn)均在獲得解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行。隨機(jī)分組30 只大鼠并稱量體重，3% 戊巴比妥鈉溶液 ( 0.15～0.2 ml / 100 g ) 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后大鼠取俯臥位，并固定于固定板上，手術(shù)區(qū)域備皮，消毒 ( 圖 1a )，鋪無菌手術(shù)巾，戴無菌手套。沿顱骨頂正中線縱向切開長約 3 cm 切口，依次切開皮膚、皮下組織，仔細(xì)分離骨膜 ( 圖 1b，c )，在雙側(cè)頂骨區(qū)域的正中位置，采用直徑為 5 mm 的磨鉆小心鉆磨顱骨同時用探針探查深度，當(dāng)顱骨接近鉆透時，可用小鑷子進(jìn)行鈍性撬撥，將骨片完全取下，避免損傷下方的硬腦膜和其表面血管 ( 圖 1d，e，f，g )。在缺損處分別放置可注射式 DBM 1 ( 傳統(tǒng)脫鈣方法制備 )，可注射式 DBM 2 ( 動態(tài)脫鈣 )，以及空白組 ( 不放置材料 )，缺損處骨膜下方和硬腦膜上方分別放置纖維素膜 ( 圖 1h )。充分止血，依次縫合各層組織，關(guān)閉傷口后碘伏消毒切口 ( 圖 1i )，術(shù)中注意觀察大鼠呼吸、心率等生命體征。術(shù)后待大鼠麻醉蘇醒后，耳標(biāo)標(biāo)記所有大鼠并將其分籠詞養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)3 天頸部皮下注射青霉素 20 萬 U / 天。手術(shù)過程中有 3 只大鼠死亡，均予以及時補(bǔ)充。

四、術(shù)后動物大體觀察

術(shù)后觀察所有動物的一般情況，如飲食、體重、排泄、運(yùn)動等以及傷口愈合情況，有無并發(fā)癥。

五、術(shù)后影像學(xué)觀察

術(shù)后 4 周和 8 周，處死大鼠后，將大鼠頻骨完整取出，利用 Mciro-CT 系統(tǒng) ( Siemens，Munich，Germany ) 掃描并行三維重建，觀察成骨情況。掃描條件：電壓 80 kVp，電流 500 mA，利用分析軟件( Cobra EXXIM，EXXIM Computing Corp.， Livermore，CA ) 進(jìn)行定量分析，選取的定量觀察區(qū)域?yàn)橹睆?5 mm，厚度 1.5 mm。

六、組織學(xué)分析

術(shù)后 8 周取材，將大鼠顱頂骨固定于 10% 多聚甲醛固定液后 24 h，用 15% EDTA ( pH 7.2～7.4 ) 室溫下?lián)u床震蕩脫鈣 2～3 周。常規(guī)石蠟包埋、切片( 厚度 5 μm )。對切片進(jìn)行蘇木精－伊紅 ( HE ) 染色，于光鏡下觀察顱骨缺損部位的愈合情況。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

圖1 可注射式 DBM 1 和 DBM 2 應(yīng)用于大鼠顱骨缺損修復(fù)Fig.1 The injectable DBM 1 and DBM 2 were applied in the rat calvarial defect model

結(jié) 果

一、材料表征觀察

通過掃描電鏡，觀察 DBM 1 和 DBM 2 表面形貌，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)骨顆粒表面孔隙較小 ( 1～2 μm )，兩者無明顯差別 ( 圖2 )。通過連續(xù)光源原子吸收光譜儀測定鈣含量百分比分別為 ( 0.3±0.1 ) % 和 ( 0.5±0.2 ) % ( 表1 )。制備成注射式 DBM 后，兩者的可注射性較強(qiáng)，有一定的韌性，但機(jī)械強(qiáng)度較差。

圖2 兩種 DBM 的掃描電鏡觀察及制備成可注射式 DBM 的大體照片 a：DBM 1 的大體照片；b：DBM 1 的表面形貌；c：DBM 2 的大體照片；d：DBM 2 的表面形貌 ( 紅色箭頭部分為 DBM 表面的孔隙結(jié)構(gòu) )Fig.2 The surface topography of DBM 1 and DBM 2 through the SEM, and the photographs of the injectable DBM 1 and DBM 2 a: The photograph of the injectable DBM 1; b: SEM of the DMB 1 showed the pore ( red arrow ); c: The photograph of the injectable DBM 2; d: SEM of the DMB 2 showed the pore ( red arrow )

表1 兩種 DBM 鈣含量測定結(jié)果 ()Tab.1 The calcium content of the DBM 1 and DBM 2 ()

表1 兩種 DBM 鈣含量測定結(jié)果 ()Tab.1 The calcium content of the DBM 1 and DBM 2 ()

分組 鈣含量百分比 ( % ) 標(biāo)準(zhǔn)值DBM 1 0.3±0.1 ＜6 DBM 2 0.5±0.2 ＜6

二、術(shù)后大鼠一般情況

術(shù)后所有大鼠飲食、排泄、活動正常，術(shù)后前3 天體重較術(shù)前有所下降，隨之逐漸上升，3 組間無顯著差異。大部分傷口愈合良好，未出現(xiàn)感染、滲血、紅腫、滲液等情況，2 只老鼠傷口有紅腫和少量滲液，術(shù)后 10 天時都恢復(fù)正常。所有大鼠無肢體無力，抽搐等并發(fā)癥，無死亡。

三、術(shù)后影像學(xué)和組織學(xué)觀察 ( 圖3、4 )

術(shù)后 4 周和 8 周的 Micro-CT 提示，DBM 2組的骨修復(fù)最好，新骨形成較多，新骨形成體積為 ( 4.6±0.8 ) mm3和 ( 7.6±1.4 ) mm3，百分比為( 30.5±5.3 ) % 和 ( 51.4±9.5 ) %；DBM 1 組中骨缺損部分修復(fù)，新骨形成體積為 ( 3.6±0.6 ) mm3和 ( 6.2±0.9 ) mm3，百分比為 ( 23.8±4.0 ) % 和( 41.9±6.1 ) %；空白組中骨修復(fù)最差，僅有少量新骨形成，新骨形成體積為 ( 1.3±0.4 ) mm3和 ( 2.1± 0.8 ) mm3，百分比為 ( 8.6±2.6 ) % 和 ( 14.2± 5.4 ) %。術(shù)后 8 周 HE 染色低倍鏡下可觀察到缺損邊緣清晰，有少量新骨生成，在缺損中央?yún)^(qū)域，空白組基本無新骨形成，只有纖維結(jié)締組織連接；在DBM 2 和 DBM 1 組中，缺損中央?yún)^(qū)域可看到未被吸收的 DBM，高倍鏡下可觀察到在其周圍有大量的新生骨組織。

圖3 術(shù)后 4 周和 8 周顱骨缺損的影像學(xué)觀察 a：空白組 4 周；b：DBM 1 組 4 周；c：DBM 2 組 4 周；d：空白組 8 周；e：DBM 1 組8 周；f：DBM 2 組 8 周；定量分析表明，DBM 2 組中的新骨形成量明顯多于 DBM 1 組Fig.3 Evaluation of mineralization in the calvarial defect via micro-CT showed mineralized bone formation at 4 and 8 weeks after the surgery a - c: At 4 weeks, the control group, the DBM 1 group and the DBM 2 group; d - f: At 8 weeks, the control group, the DBM 1 group and the DBM 2 group. The quantification analysis showed more new bone formed in the DBM 2 group when compared with the DBM 1 group

討 論

DBM 具有良好的骨誘導(dǎo)能力，從 1965 年Urist[11]報道以來，國內(nèi)外的眾多學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)明確了 DBM 的骨誘導(dǎo)能力，其主要是 DBM中的 BMP 和 β 轉(zhuǎn)化生長因子 ( transforming growth factor，TGF-β )、成纖維細(xì)胞生長因子 ( fibroblast growth factor，F(xiàn)GF )、胰島素樣生長因子 ( insulinlike growth factor，IGF-1 ) 等細(xì)胞因子成分的協(xié)同作用，誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，進(jìn)而形成軟骨組織和骨組織[11-12]。

圖4 大鼠術(shù)后 8 周組織學(xué)觀察 ( a～c HE × 40，e～f HE × 200 ) a、d：空白對照組；b、e：可注射式 DBM 1；c、f：可注射式 DBM 2；( a，b，c 比例尺為 1000 μm；d，e，f 比例尺為 100 μm ) NB：新生骨；DBM：DBM 1 / DBM 2Fig.4 H&E histological staining for the samples from the rat calvaria defect model at 8 weeks after the surgery a, d: The control group; b, e: Injectable DBM 1; c, f: Injectable DBM 2; ( a, b, c: scale bar, 1000 μm; d, e, f: scale bar, 100 μm ). NB: newly formed bone; DBM: DBM 1 / DBM 2

DBM 的傳統(tǒng)制備過程中，一般采用鹽酸在靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行脫鈣，通常持續(xù) 3～5 天，然后再進(jìn)行長時間的超聲水浴清洗。這種制備方法不僅耗時，而且在清洗過程中由于水溫的變化等原因，容易出現(xiàn)蛋白損失，從而降低 DBM 的成骨活性[8]。本課題組改良的制備方法，通過采用動態(tài)脫鈣工藝和 2 次酸化處理工藝進(jìn)行脫鈣，然后利用離心機(jī)快速清洗脫酸。在縮短制備時間的同時，可以減少制備過程中蛋白的丟失，更有利于 DBM 的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。裸鼠肌間隙的異位成骨實(shí)驗(yàn)顯示改良方法制備的 DBM 其骨誘導(dǎo)活性明顯高于傳統(tǒng)方法[9]。

臨床上需要處理的大量骨缺損，通常形態(tài)不規(guī)則。目前常用的顆?；虬魻钪补遣牧咸畛渲补?，難免會出現(xiàn)顆粒脫落或殘留死腔，從而導(dǎo)致異位成骨和骨缺損治療失敗?？勺⑸涔切迯?fù)材料可根據(jù)不同骨缺損形態(tài)而進(jìn)行術(shù)中塑型，修復(fù)骨缺損，具有塑形好、組織損傷小、操作簡便、手術(shù)并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。研究人員選取了很多材料將 DBM 進(jìn)行賦型，如纖維蛋白膠、明膠、膠原等[15-18]。本課題組利用氯化鈉溶液溶脹明膠，再復(fù)合甘油以獲得均勻、可注射的賦形劑材料[19-20]。由于氯化鈉可以改變明膠蛋白分子的結(jié)構(gòu)特征，顯著增加此材料的黏度和穩(wěn)定性，即使在超過 20 kGy 的劑量輻照滅菌之后，黏度下降不超過 30%，可滿足比重較大的藥物或功能材料 ( 8.9＞密度 P＞1.0 ) 的注射賦形需要。

在本實(shí)驗(yàn)的大鼠顱骨缺損修復(fù)模型中，改良脫鈣工藝制備的 DBM 2 較傳統(tǒng)工藝制備的 DBM 1，其表面形貌、元素組成和含量比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而影像學(xué)和組織學(xué)的結(jié)果提示，DBM 2 相較于DBM 1 在大鼠顱骨缺損修復(fù)過程中，能夠更好的促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。這說明改良方法制備的 DBM 2 較傳統(tǒng)方法制備的 DBM 1，其在保留 BMP、TGF-β、IGF-1 等細(xì)胞因子成分活性方面可能具有更大的優(yōu)勢，能夠明顯提高骨缺損的修復(fù)能力，而且其時間成本更低，更有利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

綜上所述，通過改良脫鈣方法制備的注射式DBM 能夠明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，其工藝制備時間短，更有利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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( 本文編輯：李慧文 )

Research on the injectable demineralized bone matrix for the calvarial bone defect in a rat model

LI Mao, SHEN Ya-jun, ZHAO Yan-tao, HOU Shu-xun. Department of Orthopedics, Xijing Hospital, the fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China Corresponding author: HOU Shu-xun, Email: hsxortho@hotmail.com

Objective To obverse and evaluate the physicochemical properties and ability to repair bone defects of injectable demineralized bone matrix ( DBM ) prepared by a modified decalcification technique. Methods The DBM was prepared by the modified dynamic decalcification and double circle acid treatment method. The surface topography and composition were observed through a scanning electron microscope ( SEM ). And a continuum-source atomic absorption spectrometry ( CS-AAS ) was used to determine the samples’ calcium content. The injectable DBM was prepared from DBM granules by using the excipient. We implanted the DBM 1 ( the traditional method ) and DBM 2 ( the modified dynamic decalcification and double circle acid treatment method ) into the rat calvarial defect model. A blank control group was set. Rats were euthanised at 4 and 8 weeks after the operation. The repair effects of rat calvarial defects were evaluated by micro-computed tomography and histological analyses, with quantitative comparison of the new bone. Results There were no obvious differences in the surface topography and composition between the DBM 1 and DBM 2. The calcium content was significantly lower than the standard value. The microcomputed tomography analyses consistently revealed that the bone volume of newly formed bone ( BV-NFB ) and the percentage of the BV-NFB were ( 4.6 ± 0.8 ) mm3, ( 30.5 ± 5.3 ) % ( 4 w ) and ( 7.6 ± 1.4 ) mm3, ( 51.4 ± 9.5 ) % ( 8 w ) in the DBM 2 group; ( 3.6 ± 0.6 ) mm3, ( 23.8 ± 4.0 ) % ( 4 w ) and ( 6.2 ± 0.9 ) mm3, ( 41.9 ± 6.1 ) % ( 8 w ) in the DBM 1 group; ( 1.3 ± 0.4 ) mm3, ( 8.6 ± 2.6 ) % ( 4 w ) and ( 2.1 ± 0.8 ) mm3, ( 14.2 ± 5.4 ) % ( 8 w ) in the blank control group. The DBM 2 group was superior to both the DBM 1 group and the blank control group ( P ＜ 0.05 ).The histological analyses at 8 w after the operation indicated the more new bone formed in the DBM 2 group than the DBM 1 group and the blank control group. Conclusions The DBM 2 prepared by the modified dynamic decalcification and double circle acid treatment method shows excellent osteogenic capacity when compared with the DBM 1 prepared by the traditional method, which takes a shorter time and is conducive to industrial production.

Decalcification technique; Rats; Skull; Demineralized bone matrix

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.04.011

R318

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 No. 81672130；軍事醫(yī)學(xué)項(xiàng)目 13CXZ028，AWS14C007；北京市自然科學(xué)基金 7152144；北京市科技新星項(xiàng)目 Z1511000003150134；臨床部項(xiàng)目 2014ZD001

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 ( 李矛、沈亞俊 )；100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院、北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心、全軍骨科研究所李矛 ( 趙彥濤、侯樹勛 )

侯樹勛，Email: hsxortho@hotmail.com

2017-01-16 )