林淑嫻, 張婧怡, 李利生, 吳 芹, 孫安盛

(1. 遵義醫(yī)學院 藥理學教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室, 貴州 遵義 563099; 2. 貴州省腫瘤醫(yī)院 藥劑科, 貴州 貴陽 550001; 3. 山東省濰坊市人民醫(yī)院 藥劑科, 山東 濰坊 261041)

基礎(chǔ)醫(yī)學研究

吳茱萸總堿對大鼠原代心肌細胞肥大的抑制作用

林淑嫻1,2, 張婧怡1,3, 李利生1, 吳 芹1, 孫安盛1

(1. 遵義醫(yī)學院 藥理學教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室, 貴州 遵義 563099; 2. 貴州省腫瘤醫(yī)院 藥劑科, 貴州 貴陽 550001; 3. 山東省濰坊市人民醫(yī)院 藥劑科, 山東 濰坊 261041)

目的 研究吳茱萸總堿對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導大鼠心肌細胞肥大的抑制作用, 探討其可能的作用機制。方法 應用胰酶和Ⅱ型膠原酶混合消化法制備新生大鼠原代心肌細胞。實驗隨機分為正常對照組, 模型組(AngⅡ0.1 μmol/L), Eta 1、10、100 mg/L組和Eta 100 mg/L+L-NAME(1.5×10-2mol/L)組。心肌細胞加入不同濃度Eta 30 min后再加入AngⅡ 0.1 μmol/L作用24 h。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量心肌細胞的表面積, BCA 法測定總蛋白含量, 比色法測定細胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性, RT-PCR 檢測心房利鈉肽(ANP)、絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的表達。結(jié)果 與正常對照組比較, AngⅡ 0.1 μmol/L明顯誘導心肌細胞肥大, 增加心肌細胞表面積、細胞蛋白質(zhì)含量和ANP mRNA的表達; 降低NOS活性、NO含量和eNOS mRNA表達。與模型組比較, Eta 10和100 mg/L明顯抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大, 心肌細胞表面積、蛋白質(zhì)含量及ANP mRNA的增加; 明顯增加eNOS和MKP-1 mRNA表達、NOS活性和NO的產(chǎn)生。L-NAME能取消Eta抗心肌細胞肥大效應。結(jié)論 Eta可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大, 作用機制可能與Eta增加心肌細胞NO的生成，促進MKP-1表達，增加MAPK去磷酸化有關(guān)。

吳茱萸總堿; 心肌細胞肥大; 血管緊張素Ⅱ; 一氧化氮

心室肥厚是心血管疾病獨立的危險因子, 能明顯增加心血管惡性事件的發(fā)生率和死亡率[1]。心肌細胞肥大是心室肥厚的細胞學特征, 主要表現(xiàn)為細胞體積增大、表面積增加和細胞蛋白質(zhì)合成增多。探討心肌細胞肥大的調(diào)控機制對防治心血管疾病具有重要意義。吳茱萸是我國傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)藥用其未成熟果實, 其藥性熱味苦辛, 具有降逆止嘔、散寒止痛等功效。現(xiàn)代藥理學研究證實, 吳茱萸所含生物堿具有廣泛的心血管生物活性, 如抗血管平滑肌細胞增殖[2]、抗動脈粥樣硬化[3]、維護心血管功能等作用[4-5]。近來研究表明, 吳茱萸提取物或總堿對大鼠心室肥厚具有防治作用[6-8]。該實驗旨在明確吳茱萸總堿(evodia total alkaloids, Eta)對AngⅡ誘導心肌細胞肥大的抑制作用, 并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試藥與試劑 吳茱萸總堿(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司, 純度98%, 生產(chǎn)批號: ZL130608269); N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、AngⅡ、5′-BrdU (Sigma公司); 胎牛血清(FBS)、BCA蛋白檢測試劑盒、抗α-actin抗體試劑盒(南京建成生物工程研究所); RIPA裂解液、一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所); 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、β-actin、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)引物(美國Gene ray公司)，引物序列(見表1)。

表1 RT-PCR的引物對

基因基因庫序號Forwardprimer(5'-3')Reverseprimer(5'-3')β-actinNM031144GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGACTCATCGTACTCCTGCTT-GCTGANPNM012612TGACAGGATTGGAGCCCAGAGTCGAGCAGATTTGGCTGT-TATCTTCMKP-1NM053769AATCCGGATGCAGCTCCTGTAACCCAAGGCGTCGAGCATAeNOSNM021838AGCTGGATGAAGCCGGTGACCCTCGTGGTAGCGTTGCTGA

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱、NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo公司); 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠); DMEM(美國Gibco 公司); Real-Time RT-PCR擴增儀、酶標儀、Mini Trans-Bloe電泳儀(美國BIO-RAD公司); 逆轉(zhuǎn)錄儀(德國Eppendorf公司); Leica光學顯微鏡(德國Leica公司); TMS-1015倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 動物 清潔級SD大鼠雌鼠20只, 雄鼠10只, 體重180～200 g, 購于第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心, 許可證號: SCXK(渝)2012-0005。飼養(yǎng)于貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室SPF級動物房。取1～3 d新生乳鼠心臟, 用于原代心肌細胞培養(yǎng)。

1.4 大鼠心肌細胞培養(yǎng)、分組及給藥 大鼠原代心肌細胞的培養(yǎng)參照文獻[9], 簡言之, 無菌條件下迅速取出乳鼠心尖部組織，在預冷的PBS液中清洗后剪為1～3 mm3組織塊, 經(jīng)胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶混合消化, 用20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮, 置CO2孵箱中差速貼壁60 min。取上清, 細胞培養(yǎng)前5′-BrdU抑制非心肌細胞增殖, 然后改為無胎牛血清的 DMEM 同步化24 h。實驗分為正常對照組(不含血清DMEM培養(yǎng)基), 模型組(AngⅡ 0.1 μmol/L), Eta低(Eta 1 mg/L)、中(Eta 10 mg/L)、高(Eta 100 mg/L)濃度組和Eta-H+L-NAME組(Eta 100 mg/L+L-NAME 1.5×10-2mol/L)組。Eta各試藥組加入Eta 30 min后再加入AngⅡ0.1 μmol/L, 作用24 h后檢測各項指標。

1.5 心肌細胞鑒定 將載有心肌細胞生長的玻片, 經(jīng)PBS漂洗, 4%多聚甲醛固定, 加一抗(抗大鼠α-actin), 4 ℃濕盒過夜, 生物素化二抗, DAB顯色, 再經(jīng)蘇木素復染胞核后梯度酒精濃度脫水, 中性樹脂封片。相差顯微鏡下觀察, 胞質(zhì)染為棕黃色為心肌細胞。

1.6 檢測量心肌細胞表面積 細胞密度1×106個/mL, 接種于含蓋玻片的6孔板中, 每組5孔，各組給藥后培養(yǎng)24 h, 相差法拍攝細胞, 使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量單個細胞的表面積, 每組隨機拍攝5張圖片, 每個圖片隨機檢測10個細胞, 取平均值。

1.7 測量心肌細胞蛋白含量 心肌細胞總蛋白質(zhì)含量的測定, 心肌細胞5×105個/mL密度接種于24孔板中(每組5孔), 各組加入不同試藥24 h后吸棄培養(yǎng)基, 經(jīng)RIPA裂解30 min, 收集細胞, 冰浴下超聲破碎細胞, 4 ℃, 12 000 ×g離心30 min, 吸取上清液按BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書操作。酶標儀波長562 nm, 檢測每孔細胞的蛋白含量, 進而計算出每組單個細胞的蛋白含量。

1.9 檢測基因的表達 細胞密度2.0×106個/mL接種于12.5 mL培養(yǎng)瓶, 培養(yǎng)48 h后Trizol一步法提取細胞總RNA, 紫外分光光度計波長260和280 nm檢測吸光度值(A), 兩者比值1.8～2.0, 純度良好。兩步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA：反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反應終止。Real-time PCR擴增：反應條件95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火，循環(huán)40 次。采用相對定量法分析PCR結(jié)果，以β-actin基因為內(nèi)參照，使用2-ΔΔCt法計算ANP、MKP-1和NOS基因的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞形態(tài)觀察及鑒定 顯微鏡下觀察結(jié)果(見圖1)顯示, 培養(yǎng)的心肌細胞3 h后見其貼壁生長, 培養(yǎng)1 d可見多數(shù)心肌細胞自發(fā)搏動, 初期心肌細胞呈圓形, 3～4 d后為梭形并逐漸伸出偽足, 形成不規(guī)則的星形, 交織成網(wǎng), 細胞核1～2個。培養(yǎng)的心肌細胞經(jīng)α-肌動蛋白免疫組化染色, 胞質(zhì)染為棕黃色被視為心肌細胞, 心肌細胞陽性率達 95%以上, 符合實驗要求。

圖1 α-肌動蛋白免疫組化染色鑒定心肌細胞(×400)

2.2 Eta對AngⅡ誘導心肌細胞肥大的抑制作用 表2結(jié)果表明, 與正常對照組比較, 模型(Ang II)組顯著增加心肌細胞的表面積和心肌細胞的蛋白含量, 分別增加了2倍和1.6倍。RT-PCR結(jié)果顯示, 正常心肌細胞ANP mRNA表達低, 模型組與正常對照組比較, ANP mRNA的表達增加了近1倍。Eta 1、10 和100 mg/L抑制心肌細胞肥大作用呈現(xiàn)一定的濃度-效應關(guān)系, 對心肌細胞表面積的抑制率分別是9%、35.2%和57.2%; 蛋白含量的抑制率分別為5.8%、25.2%和44.7%; 下調(diào)AngⅡ誘導的ANP mRNA表達增加, 分別下調(diào)14.7%、21.8%和 38.1%。

為了排除Eta給藥濃度過大產(chǎn)生的毒性作用, 影響對心肌細胞指標的觀察, 實驗設(shè)有所用Eta最大給藥濃度(100 mg/L)對照組, 結(jié)果表明該濃度對各觀察指標沒有明顯影響(P>0.05)。

組別Eta(mg/L)細胞表面積(μm2)蛋白質(zhì)(pg) ANPmRNA(表達)正常對照158±1317±5785±10正常+Eta高濃度100162±1329±3086±8AngⅡ(模型)組487±21##837±46##166±20##AngⅡ+Eta低濃度1445±20789±24142±4AngⅡ+Eta中濃度10315±10**626±40**130±3*AngⅡ+Eta高濃度100208±10**462±38**103±14**AngⅡ+Eta高濃度+L-精氨酸甲酯100458±16757±72134±15

##:與正常對照比，P<0.01；*:與模型組比，P<0.05；**:與模型組比，P<0.01。

2.3 Eta對AngⅡ誘導所致肥大心肌細胞NO含量和NOS活性的影響 表3結(jié)果表明,與正常對照組相比,模型組培養(yǎng)基中NO含量和NOS活性顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,Eta中、高濃度組培養(yǎng)基中NO含量和NOS活性明顯升高(P<0.01);Eta低濃度組NO含量和NOS活性有增加趨勢,但增加不明顯(P>0.05);Eta高濃度+L-精氨酸甲酯組NO含量和NOS活性與模型組比較無明顯變化(P>0.05),表明Eta促進NO生成和增強NOS活性的作用被L-精氨酸甲酯取消。

組別Eta(mg/L)NO含量(μmol/L) NOS活性(U/mL) 正常對照1.56±0.344.40±0.74AngⅡ(模型)0.50±0.06##2.31±0.25##AngⅡ+Eta低濃度10.64±0.062.73±0.07AngⅡ+Eta中濃度100.81±0.06**3.00±0.07**AngⅡ+Eta高濃度1001.42±0.24**4.01±0.77**AngⅡ+Eta高濃度+L-精氨酸甲酯1000.46±0.072.49±0.13

##：與正常對照比，P<0.01；**：與模型組比，P<0.01。

2.4 Eta對AngⅡ所致肥大心肌細胞MKP-1和eNOS mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結(jié)果(見表4)顯示,與正常對照組相比,模型組MKP-1和eNOS mRNA的表達顯著下調(diào),分別下降了49%(P<0.01)和75.2%(P<0.01)。與模型組比較,Eta中、高濃度組顯著增加MKP-1和eNOS mRNA的表達;低濃度Eta的影響不明顯(P>0.05)。

組別Eta(mg/L)基因表達MKP-1eNOS正常對照100.00±3.17100.00±3.40AngⅡ(模型)51.02±2.50##24.81±3.77##AngⅡ+Eta低濃度153.79±3.8125.89±3.32AngⅡ+Eta中濃度1074.09±4.10*47.10±2.59**AngⅡ+Eta高濃度10085.57±2.24**74.79±3.79**

##：與正常對照組比，P<0.01；*：與模型組比，P<0.05；**：與模型組比，P<0.01。

3 討論

目前體外原代心肌細胞培養(yǎng)技術(shù)已廣泛用于心血管疾病及藥物的研究中。為了避免胰酶消化液反復多次使用對心肌細胞的損傷[10]，實驗采用胰酶和Ⅱ型膠原酶混合消化液，分離、提取心肌細胞，同時加入5-溴脫氧尿苷抑制成纖維樣細胞的生長，從而可以獲得高純度的心肌細胞。提取、純化的心肌細胞，通過特征性抗原標記物α-actin免疫組織化學鑒定，心肌細胞純度大于95%。

AngⅡ是體內(nèi)重要活性物質(zhì)，其與AT1受體結(jié)合可活化多條信號通路,其中PLC、PKC、SRE在AngⅡ誘導的肥大反應中可能起關(guān)鍵作用；AngⅡ也可以直接活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK),MAPK在多種致肥大因子介導的心肌肥大反應中起關(guān)鍵作用，活化的MAPK通過轉(zhuǎn)位方式進入細胞核，激活其下游底物,調(diào)控細胞生長反應。故AngⅡ現(xiàn)已成為誘導心肌細胞肥大常用的工具藥。

我們近期的研究證實吳茱萸提取物和Eta對大鼠心室肥厚具有明顯的抑制作用[6-7]，該實驗旨在明確Eta對心肌細胞的直接影響。實驗結(jié)果表明，Eta 10和100 mg/L明顯降低肥大心肌細胞表面積和蛋白含量，同時下調(diào)心肌肥大標志性基因ANP的表達，表明Eta對AngⅡ誘導心肌細胞肥大具有抑制作用。為排除高濃度Eta的毒性作用，實驗還設(shè)立了Eta最大給藥濃度(100 mg/L)空白對照組，結(jié)果表明這一劑量對心肌細胞的生長無明顯影響。

NO是體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，eNOS具有合成NO的能力，eNOS主要表達于血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞中。已有大量研究證實NO具有抗心肌肥大的作用[11-14]，有報道指出給予合成NO的前體物質(zhì)L-精氨酸后能誘導肥厚心肌組織中eNOS和MAPK磷酸酶-1(MKP-1)的表達，MKP-1使p-MAPK去磷酸化而使后者失活，產(chǎn)生抗心肌細胞肥大作用[14]，這一作用可被NOS抑制劑L-NAME阻斷。本實驗結(jié)果表明Eta中、高劑量組在抑制AngⅡ誘導心肌細胞肥大的同時能上調(diào)eNOS和MKP-1 mRNA的表達，增加NOS的活性和NO的含量。NOS抑制劑L-NAME與Eta合用，能抑制后者增加NO產(chǎn)生的同時，取消了Eta抗心肌細胞肥大作用，進一步提示Eta的抗心肌細胞肥大作用與上調(diào)eNOSmRNA的表達，增加NO的生成，促進MKP-1的表達，增加了MAPK去磷酸化實現(xiàn)的。

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[收稿2016-11-10;修回2016-12-28]

(編輯：王靜)

Evodia total alkaloids protect against rat cardiomyocyte hypertrophy in vitro

LinShuxian1, 2,ZhangJingyi1, 3,LiLisheng1,WuQin1,SunAnsheng1

(1. Department of Pharmacology and The Key Laboratory of Basic Pharmacology of Guizhou Province, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Pharmacy, Guizhou Cancer Hospital, Guiyang Guizhou 550001, China; 3. Department of Pharmacy, Weifang People’s Hospital, Weifang Shandong 261041, China)

Objective This study was designed to investigate the inhibition of evodia total alkaloids (Eta) on rat cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ(Ang II) in vitro and to explore the underlying mechanisms. Methods The primary cardiomyocytes were isolated from neonatal Sprague Dawley rats by using trypsin and type Ⅱ collagenase, and stained with anti-α-smooth-muscle-actin antibody by an immunohistochemistry method for identification. The cultured cardiomyocytes were randomly divided into 6 groups and marked as normal control group, model (AngⅡ0.1 μmol/l) group, Eta (1, 10, 100 mg/l) group, and Eta (100 g/l) + L-NAME (1.5×10-2mol/l) group. The cardiomyocytes were pretreated with Eta for 30 min and subsequently stimulated with Ang II 0.1 μmol/l. The cardiomyocyte surface area was measured with Image-Pro Plus 6.0 imaging analytic system, and the content of cell protein was determined by BCA assay. The activity of nitric oxide synthetase (NOS) and the content of nitric oxide (NO) were detected, respectively. The mRNA levels of atrial natriuretic peptide (ANP), mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 (MKP-1) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the cardiomyocytes were analyzed by RT-PCR.Results Compared with the normal control group, Ang II (0.1 μmol/l) significantly induced cardiomyocytes hypertrophy which includes larger cell surface area, higher protein content, as well as the re-expression of ANP. The results further revealed that Eta (10, 100 mg/l) could obviously protect against Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy, which was associated with enhancing the activity of NOS and the content of NO, and up regulating the gene expressions of eNOS and MKP-1. The data also demonstrated that L-NAME could abolish the effect of Eta on anti-cardiomyocyte hypertrophy.Conclusion The present study suggests that Eta (10, 100 mg/l) could attenuate Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy by increasing the production of NO, promoting the gene expression of MKP-1, and improving the phosphorylation of MAPK.

evodia total alkaloids; cardiomyocyte hypertrophy; Ang II; nitric oxide

國家自然科學基金資助項目(NO: 81160528)。

孫安盛, 男, 教授, 碩士生導師, 研究方向: 心血管藥理學, E-mail:sunansheng1945@163.com。

R285

A

1000-2715(2017)01-0017-05