梁龍輝 劉石磊 劉昌財(cái) 黃桂蘭 向宇 李欣海 于惠蘭

摘要 針對芥子氣（HD）染毒血漿的溯源性分析需求，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UHPLCMS/MS），建立了人血漿中6種HD生物標(biāo)識物（TDG，TDGO，SMO，SBMSE，MSMTESE，SBSNAE）的高靈敏度和專屬性檢測方法。應(yīng)用甲醇和乙腈混合有機(jī)溶劑沉淀HD染毒血漿中的蛋白，然后用HLB柱固相萃?。⊿PE）純化，經(jīng)超高效液相色譜梯度洗脫分離，在三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下進(jìn)行定性與定量檢測。結(jié)果表明，6種目標(biāo)物的線性范圍為0.05～500ng/mL（R2=0.9840～0.9955），檢測限在0.01～1.0ng/mL之間，各分析物的精密度（n=5）≤5.5%，加標(biāo)回收率在86.5%～110.8%之間。本方法通過SPE的引入和UHPLC程序的優(yōu)化，有效地解決了基質(zhì)背景對分析可靠性的影響問題，并成功應(yīng)用于國際禁止化學(xué)武器組織（OPCW）第5次生物醫(yī)學(xué)樣品分析演練HD染毒血漿樣品的鑒定。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；芥子氣；生物標(biāo)識物；血漿

1引言

芥子氣（HD）是一種糜爛性化學(xué)毒劑，化學(xué)名為2，2′二氯二乙硫醚，可通過吸入、皮膚和眼睛暴露等方式中毒，造成皮膚、眼睛、呼吸道等出現(xiàn)不同程度的損傷[1，2＼]。兩次世界大戰(zhàn)以及80年代爆發(fā)的兩伊戰(zhàn)爭中都使用了大量HD，造成了大量軍民傷亡[3～5＼]。侵華日軍戰(zhàn)敗后在中國境內(nèi)遺棄了大量包括芥子氣在內(nèi)的化學(xué)毒劑，長期以來對環(huán)境以及附近平民都造成了嚴(yán)重危害[6，7＼]。1997年OPCW發(fā)布并生效的《化學(xué)武器公約》（CWC）嚴(yán)格禁止了HD的生產(chǎn)、儲存和使用，但至今其銷毀工作還未完成；同時(shí)由于HD容易生產(chǎn)、性質(zhì)穩(wěn)定，一旦被不法分子利用，還會極大地威脅公共安全。因此，有必要發(fā)展并建立靈敏、可靠的分析方法對HD染毒樣品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，對違約使用的調(diào)查取證、染毒人員的診斷救治都具有重要意義[8＼]。

HD含有兩個(gè)親電中心，進(jìn)入生物體后迅速分布于各組織中，發(fā)生代謝反應(yīng)可能生成水解氧化產(chǎn)物、β裂解產(chǎn)物和大分子加合物等一系列化合物[9，10＼]。這些代謝物按照其來源及特點(diǎn)分為兩類：小分子游離代謝物和大分子加合代謝物[11～13＼]。小分子游離代謝物包括硫二甘醇（TDG）、硫二甘醇亞砜（TDGO）及芥子氣亞砜（SMO）等水解、氧化產(chǎn)物，以及與谷胱甘肽加合后經(jīng)β裂解酶作用產(chǎn)生的1，1′磺?；p＼[2（甲基亞磺酰基）乙烷＼]（SBMSE），1甲基亞磺?；?＼[2（甲硫基）乙基磺酰基＼]乙烷（MSMTESE），1，1′磺酰基雙＼[2S（N乙酰半胱氨?；┮彝椋躚（SBSNAE）等β裂解產(chǎn)物（如圖1所示）。在小分子代謝物中，雖然文獻(xiàn)＼[5＼]報(bào)道了在生物體內(nèi)檢測出痕量的內(nèi)源性TDG和TDGO，但在HD染毒的生物醫(yī)學(xué)樣品中，TDG與TDGO的濃度顯著升高，而且這些化合物均具有HD的結(jié)構(gòu)特征，因此，這些小分子代謝物均可作為HD生物標(biāo)識物[11＼]。與大分子加合物相比，小分子標(biāo)識物在芥子氣暴露后很快出現(xiàn)在體液中，能夠在體內(nèi)存在數(shù)日至兩周，并且具有檢測快速的優(yōu)點(diǎn)，是染毒早期快速診斷的理想標(biāo)識物。

對于HD小分子標(biāo)識物的分析，大多采用GCMS/MS或LCMS/MS等技術(shù)分析其衍生產(chǎn)物或原體[14～17＼]，但由于不同標(biāo)識物的性質(zhì)差異，這些報(bào)道大都只針對單個(gè)或兩個(gè)標(biāo)識物進(jìn)行分析。但HD染毒劑量、方式以及染毒時(shí)間的不同所產(chǎn)生的生物標(biāo)識物也不盡相同[16＼]，因此，所建立的方法應(yīng)能更廣泛用于標(biāo)識物和樣品的分析。直到2013年，Li等[18＼]報(bào)道了將血漿蛋白沉淀后直接進(jìn)行LCMS/MS的分析方法，可同時(shí)檢測7種HD游離代謝物。方法制備簡單、耗時(shí)短，取得了較好的結(jié)果。但該方法中血漿經(jīng)蛋白經(jīng)沉淀直接分析，基質(zhì)依然復(fù)雜，背景中存在大量干擾峰，分析大量樣品后會造成色譜柱壓升高、響應(yīng)降低、儀器穩(wěn)定性變差等問題。

針對以上情況，本研究引入SPE制備方法，并優(yōu)化了UHPLC的梯度洗脫程序，建立了血漿中6種HD標(biāo)識物（TDGO，SBMSE，SBSNAE，TDG，MSMTESE和SMO）的UHPLCMS/MS定量分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方靈敏度高、選擇性好、樣品基質(zhì)純凈，大批量樣品分析響應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好。JP

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、材料及試劑

1290超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）；6460型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）；Centrifuge5424型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；NEVAP111型氮?dú)獯蹈蓛x（美國OrganomationAssociates公司）。

HD、TDG、TDGO、SMO、SBMSE、MSMTESE及SBSNAE（均由本單位合成，NMR分析純度>95%）；HLB固相萃取柱（500mg/6mL，美國Waters公司）；水、甲醇、乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）；甲酸銨（美國RoeScientific公司）；健康人血漿部分由北京紅十字中心提供，部分來自于本實(shí)驗(yàn)室的自愿者。JP

2.2安全措施

所有涉及到芥子氣的操作，如取用、配制和染毒過程均需要佩戴相應(yīng)的防護(hù)器材，并在通風(fēng)良好的狀況下進(jìn)行；以NaOH乙醇（1KG-3∶KG-510～1KG-3∶KG-511，V/V）混合溶液作為洗消劑，各種直接接觸芥子氣的實(shí)驗(yàn)器材在使用后立即洗消。

2.3染毒及加標(biāo)血漿的制備

用乙腈配制1.0mg/mLHD標(biāo)準(zhǔn)工作液，吸取4.0μL標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入4.0mL空白血漿，混勻、37℃振蕩反應(yīng)12h，得到1.0μg/mLHD染毒血漿儲備液。用純水配制6種HD標(biāo)識物的混合標(biāo)準(zhǔn)液，各標(biāo)識物濃度均為100μg/mL，用空白血漿稀釋為0.01～500ng/mL的加標(biāo)血漿。以上儲備液均于

20℃保存。

2.4樣品制備

參照文獻(xiàn)＼[18＼]方法對血漿樣品進(jìn)行蛋白沉淀。0.5mL血漿中加入2.0mL乙腈甲醇（4KG-3∶KG-51，V/V），渦旋混勻，6100r/min離心5min，移取上清液。向沉淀中繼續(xù)加入1.0mL乙腈甲醇（4KG-3∶KG-51，V/V），渦旋混勻、12200r/min離心5min，將兩次的上清液合并，氮?dú)獯蹈桑?.0mL純水復(fù)溶，離心收集上清液，加入60μL1.4%氨水準(zhǔn)備進(jìn)行SPE。

先后用5mL甲醇、12mL水和5mL1.4%氨水平衡HLB柱；上樣，分別用3mL1.4%氨水和2mL2%甲醇1.4%氨水淋洗；最后用4mL含2%甲酸甲醇進(jìn)行洗脫；濃縮洗脫液至近干，加入0.15mL純水復(fù)溶，離心后取上清液進(jìn)行LCMS分析。

2.5液相色譜質(zhì)譜分析條件

色譜條件：ZorbaxEclipsePlusC18色譜柱（100mm×2.1mm，1.8μm，美國Agilent公司）；流動(dòng)相A為5mmol/L甲酸銨溶液，B為含5mmol/L甲酸銨的甲醇溶液；洗脫梯度：0～2.5min，5%～10%B；2.5～5.0min，10%～100%B；5.0～8.0min，100%B；8.0～8.1min，100%～5%B，運(yùn)行3min；流速0.3mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣體積10μL。

質(zhì)譜條件：在ESI+模式下采用MRM方式掃描，應(yīng)用4個(gè)時(shí)間段掃描6個(gè)目標(biāo)物的定量及定性離子對，0～1.75min掃描SBSME和TDGO；1.75～3.60min掃描SBSNAE和TDG；3.60～4.65min內(nèi)掃描MSMTESE；4.65min后掃描SMO。毛細(xì)管電壓4.0kV，離子源溫度350℃；霧化氣壓力35psi；碰撞加速電壓3V，權(quán)重為1/x。其它參數(shù)見表1。

3結(jié)果與討論

3.1固相萃取條件的選擇

與文獻(xiàn)＼[18＼]相比，針對血漿基質(zhì)的復(fù)雜性，增加了固相萃取步驟，目標(biāo)是進(jìn)一步除去基質(zhì)中的背景干擾物，使制備后的樣品更加純凈，提高檢測靈敏度和定量穩(wěn)定性。6種化合物的極性順序?yàn)門DGO>SBMSE>SBSNAE>TDG>MSMTESE>SMO，其中TDGO與SBMSE，SBSNAE與TDG，MSMTESE與SMO的極性相近，因此，選擇3種化合物SBMSE、TDG和MSMTESE進(jìn)行血漿加標(biāo)（濃度均為10ng/mL），考察了BondElutePlexa（60mg，3mL），SampliQPSDVB（500mg，6mL），HLB（500mg，6mL），以及HLB（60mg，3mL）JP4種SPE柱的富集效果，結(jié)果見圖2。

BondElutePlexa柱的填料為疏水性的二乙烯及苯基聚合物，主要用于富集弱極性化合物，而SBMSE及TDG等目標(biāo)物的極性相對較強(qiáng)，因此回收率低。而PSDVB柱的填料為聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物，適用于從水溶液中提取極性芳香化合物，如苯酚等，不適于本文目標(biāo)物的富集。HLB采用二乙烯苯和N乙烯基吡咯烷酮的親水親脂兩性填料，可富集的化合物極性范圍更寬。此外，還考察了60mg小柱床的HLB柱，以期在不損失回收率的情況下，減少背景干擾，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明60mg的SPE柱的容量有限，回收率偏低，不適于0.5mL血漿樣品的富集。因此，經(jīng)比較，本實(shí)驗(yàn)最終選擇回收率最高的HLB（500mg/6mL）柱對6種HD標(biāo)識物的加標(biāo)樣品進(jìn)行SPE純化。

目標(biāo)化合物都顯弱堿性，加入60μL1.4%氨水，目的是降低目標(biāo)化合物的極性，增強(qiáng)與HLB柱填料疏水基團(tuán)的結(jié)合。經(jīng)過比較考察，最終選擇先用3.0mL1.4%氨水淋洗殘留在柱上的雜質(zhì)，再用2.0mL含1.4%氨水的2%甲醇淋洗柱子上非特異性結(jié)合的極性干擾物。此外，向洗脫液中添加2%甲酸是為了降低目標(biāo)物在HLB柱上的結(jié)合力，使其更容易被洗脫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPE在有效富集目標(biāo)物的同時(shí)，除去了血漿基質(zhì)中的大量背景干擾，色譜圖基線干凈（圖3），延長了色譜柱的使用壽命。

3.2UHPLCMS/MS方法的優(yōu)化

根據(jù)6種化合物的理化性質(zhì)及三重四極桿質(zhì)譜的特點(diǎn)，在ESI+模式下應(yīng)用Masshunteroptimizer軟件對每一個(gè)目標(biāo)化合物的分析參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。為了在較短時(shí)間內(nèi)獲得良好的分離效果，對洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。由于TDGO和SBMSE這兩種化合物極性很強(qiáng)，所以在前2.5min內(nèi)沒有采用等度平衡程序，目的是將目標(biāo)物與基質(zhì)中的強(qiáng)極性背景化合物進(jìn)行分離，減少干擾；MSMTESE和SMO在色譜柱上保留較好，為了縮短分析時(shí)間，采用快速梯度洗脫程序?qū)δ繕?biāo)物進(jìn)行洗脫。在優(yōu)化的洗脫條件下，6種HD標(biāo)識物在6min內(nèi)均有較好的分離（圖3），TDG和SBSNAE的保留時(shí)間重合，可通過MRM離子對m/z的差異進(jìn)行區(qū)分。此外，本研究采用4個(gè)時(shí)間段同時(shí)分析6個(gè)HD代謝物的12個(gè)MRM離子對，使每個(gè)峰能獲得定量分析所需的足夠掃描點(diǎn)數(shù)，改善峰形和靈敏度。

3.3方法學(xué)考察

3.3.1專屬性在最佳色譜質(zhì)譜條件下，測試溶劑空白（純水）、空白血漿、加標(biāo)血漿（6種標(biāo)識物濃度均為50ng/mL）和HD染毒血漿（100ng/mL）樣品。溶劑空白中未檢出任何相關(guān)化合物（圖4A），表明儀器系統(tǒng)中沒有相關(guān)背景干擾。空白血漿中僅檢測到少量內(nèi)源性TDGO和TDG（圖4B），濃度分別為2～8ng/mL和0～5ng/mL，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致。50ng/mL加標(biāo)血漿樣品中6種化合物的響應(yīng)良好（圖5A）。在100ng/mLHD染毒血漿中發(fā)現(xiàn)了顯著高于空白血漿的TDGO和TDG，可以作為HD染毒依據(jù)（圖5B）。在體外染毒血漿樣品中沒有檢測到SMO的原因是在低濃度染毒時(shí)HD主要發(fā)生水解反應(yīng)，自身氧化反應(yīng)很少[8＼]。β裂解產(chǎn)物是由HD與谷胱甘肽的加合物在β裂解酶的作用下而生成，但谷胱甘肽主要存在于血細(xì)胞中，離心后的血漿中谷胱甘肽含量極少，所以未檢測到。但是，在真實(shí)染毒患者體內(nèi)，HD既可能發(fā)生水解、氧化反應(yīng)，還可能與血液中的谷胱甘肽充分反應(yīng)后釋放出β裂解產(chǎn)物，染毒人員血液經(jīng)離心得到的血漿中可能存在水解氧化及β裂解標(biāo)識物[18＼]。因此，本方法依然可應(yīng)用于真實(shí)HD染毒患者體內(nèi)代謝后的血漿樣品分析。4種樣品的MRM色譜圖比較結(jié)果顯示，空白血漿中除低水平的TDGO和TDG內(nèi)源性本底外，無其它干擾物，表明本方法專屬性較好。

3.3.2線性范圍、方法檢出限及定量限為了降低基質(zhì)效應(yīng)對檢測準(zhǔn)確度的影響，本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。將濃度為0.01～500ng/mL的加標(biāo)血漿按照2.4和2.5節(jié)進(jìn)行處理分析。以目標(biāo)物的濃度和峰面積進(jìn)行線性回歸，權(quán)重為1/x，繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。以響應(yīng)顯著高于空白血漿且信噪比為3對應(yīng)的濃度作為方法的檢出限（LOD），信噪比為5且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于20%所對應(yīng)的濃度作為方法的定量限（LOQ）[18＼]，結(jié)果見表2。6種目標(biāo)物均有較寬的線性范圍，SBMSE、SBSNAE和MSMTESE的檢出限與文獻(xiàn)＼[18＼]報(bào)道一致，而SMO、TDG與TDGO的靈敏度比文獻(xiàn)值提高了5～10倍（表3）。

3.3.3加標(biāo)回收率與精密度對5，150和450ng/mL的加標(biāo)血漿質(zhì)量控制樣品（LQC，MQC和HQC）進(jìn)行平行處理并分析，每個(gè)樣品重復(fù)測定5次。計(jì)算各目標(biāo)化合物的精密度和回收率，結(jié)果見表4。6種化合物的回收率在86.5%以上，RSD<5.5%，均符合方法學(xué)要求。

3.4HD染毒樣品分析

CM（42OPCW在2015年第5次生物醫(yī)學(xué)樣品分析演練中提供了6份懷疑HD中毒人員的血漿樣品CM）LM

（A～F），和1份空白血漿（M）。采用所建方法對所ZH（有

樣品進(jìn)行定性及定量分析，檢測結(jié)果見圖6。在C樣品中檢測到的TDG及TDGO與血漿基質(zhì)M一致，所以確定C樣品為空白血漿；在A，B，D，E和F樣品中都檢測到高于內(nèi)源水平的TDG與TDGO，根據(jù)檢測得到TDG與TDGO的含量大小，得出樣品染毒濃度順序?yàn)镕>A>E>D>B。OPCW發(fā)布的結(jié)果中C為空白血漿，A，B，D，E和F分別為100，10，40，50和150ng/mLHD染毒血漿，說明本方法的CM（21*3/4檢測結(jié)果與OPCW官方提供的染毒信息一致?？誄M）ZH）

白血漿中內(nèi)源TDG與TDGO的分析結(jié)果表明，HD對血漿的染毒濃度在10ng/mL以上時(shí)，可利用TDG和TDGO作為標(biāo)識物進(jìn)行HD的溯源性分析，而之前未有此方面報(bào)道。另外有意義的是，本方法檢測到的TDG與TDGO的濃度和與HD染毒濃度（10～150ng/mL，OPCW提供）呈良好的線性關(guān)系，這使得依據(jù)檢測染毒血漿樣品中標(biāo)識物的濃度檢測實(shí)際HD染毒濃度成為可能，但由于代謝物的濃度還與染毒時(shí)間密切相關(guān)，特別是在體內(nèi)染毒情況下，因此，代謝標(biāo)識物與染毒濃度之間的關(guān)系還需要進(jìn)行深入探討。

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、

AbstractAsensitivemethodwasdevelopedforthesimulationdeterminationofsixkindsofsulfurmustards（HD）biomarkers（TDGO，SBMSE，SBSNAE，TDG，MSMTESEandSMO）inhumanplasmabyultrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry（UHPLCMS/MS）.HDexposedplasmasampleswerepretreatedwithamixedsolventofmethanolandacetonitriletoprecipitateproteins.Asolidphaseextraction（SPE）methodwithHLBcartridgewasusedtopurifythetargetbiomarkersfromthematrix.AcompleteseparationwasachievedonanUHPLCsystemwithagradientelution.Thequalitativeandquantitativeanalyseswerecarriedoutbytriplequadrupoletandemmassspectrometryinmultiplereactionmonitoring（MRM）mode.Theresultsshowedthatthecalibrationcurvesforthe6biomarkerswerelinear（R2=0.9840-0.9955）overtherangefrom0.05to500ng/mL，withthelimitsofdetection（LODs）of0.01-1.0ng/mL.Therelativestandarddeviation（RSD，n=5）was≤5.5%，andtherecoveryoftheanalytesrangedfrom86.5%to110.8%.Theinfluenceofthematrixbackgroundsonthemethod'srobustnesswaseffectivelydiminishedbyintroducingSPEprocedureandbyoptimizingtheUHPLCelutionprogram.ThemethodwassuccessfullyappliedtothefifthbiomedicalsampleanalysisexerciseorganizedbytheOrganizationfortheProhibitionofChemicalWeapons（OPCW）.

KeywordsUltrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry；Sulfurmustard；Biomarkers；Plasma

HQWT6JY（Received8May2016；accepted23August2016）