高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲含量

劉信奎，王萌萌，張連成，王超眾△

（1.黑龍江省齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 齊齊哈爾 161005； 2.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲含量

劉信奎1，王萌萌2，張連成1，王超眾1△

（1.黑龍江省齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 齊齊哈爾 161005； 2.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

目的建立測(cè)定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲含量的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS／MS）法。方法 采用HPLCMS／MS儀，選用Waters Atlantis T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 αm），以甲醇-0.1%甲酸水（40∶60）為流動(dòng)相，流速為0.2 mL／min，柱溫為30℃，電噴霧電離（ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式。結(jié)果 該樣品質(zhì)量濃度在1.011～30.33 αg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0.999 7），回收率為99.09%，RSD＝1.55%(n＝9)，穩(wěn)定性良好。結(jié)論 該方法分析快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）的質(zhì)量控制。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）；格列本脲；含量；質(zhì)量控制

近年來，臨床應(yīng)用二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）治療2型糖尿病，已取得了較好的效果[1]。處方中格列本脲（glibenclamide）是治療非胰島素依賴型糖尿病有效且安全的一線藥物[2]，且起效快、降糖作用強(qiáng)、療效確切、價(jià)格便宜，在國(guó)內(nèi)糖尿病的治療中仍廣泛應(yīng)用[3-11]。2015年版《中國(guó)藥典(二部)》所載二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲的含量測(cè)定方法為高效液相色譜（HPLC）法[12]16，目前筆者尚未檢索到采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS／MS）法對(duì)該藥品進(jìn)行分析的文獻(xiàn)報(bào)道。與HPLC法相比，HPLC-MS／MS法的專屬性更強(qiáng)、靈敏度更高，更適用于該藥品的定性鑒別和含量測(cè)定等的質(zhì)量控制，也為該藥品的痕量測(cè)定提供方法學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源、B.05.00版Masshunter色譜工作站軟件，美國(guó)安捷倫公司）；BP 211D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試藥

格列本脲對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100135-201105）；二甲雙胍格列本脲膠囊（浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司，批次編號(hào)為1，2，3，格列本脲標(biāo)示量均為1.25 mg）；甲醇（DikmaPure公司，批號(hào)為612201）為色譜純；甲酸（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)為20130705）為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱WatersAtlantisT3C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水（40∶60）；流速：0.2 mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

圖1 格列本脲全掃描二級(jí)質(zhì)譜圖

質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）進(jìn)行定量分析。干燥氣和霧化器均為氮?dú)猓桓稍餁鉁囟龋?00℃；干燥氣流量：20 L／min；鞘氣流量：10 L／min，毛細(xì)管電壓：4 500 V；噴嘴電壓：2 000 V；掃描時(shí)間：0.2 s；格列本脲母離子質(zhì)荷比（m／z）：495.01，子離子（m／z）：368.20，168.77，303.05；定量離子（m／z）：368.20。離子全掃描二級(jí)質(zhì)譜圖見圖 1?？梢?，格列本脲打碎出了3個(gè)明顯的二級(jí)碎片離子，且響應(yīng)值較強(qiáng)，豐度比穩(wěn)定，因此亦為該種化合物的專屬性鑒別提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取格列本脲對(duì)照品10.11 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液（200 μg／mL）。精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取樣品20粒的內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于格列本脲5 mg），精密稱定，置25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

陰性對(duì)照品溶液：按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方比例，同法制備不含格列本脲的陰性樣品，依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLCMS／MS定量離子離子流色譜圖，結(jié)果見圖2?？梢?，組分出峰的區(qū)域無干擾峰，且陰性對(duì)照基底響應(yīng)值極低，表明處方中其他成分及輔料對(duì)樣品的測(cè)定無干擾。

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品貯備溶液0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配成格列本脲對(duì)照品系列溶液，按擬訂色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄定量離子總粒子流色譜圖，以格列本脲峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、格列本脲質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝100 789 X-900.1，r＝0.999 7(n＝6)。結(jié)果表明，格列本脲質(zhì)量濃度在1.011～30.33 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。將對(duì)照品系列溶液繼續(xù)稀釋，進(jìn)樣分析，記錄信噪比（S／N）為10時(shí)格列本脲的質(zhì)量濃度(即定量限)為0.4 ng／mL。

圖2 格列本脲HPLC-MS／MS定量離子離子流色譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄格列本脲峰面積。結(jié)果的 RSD為0.11%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ)(批次編號(hào)為1）6份，依法進(jìn)樣測(cè)定其含量。結(jié)果平均含量為97.53%，RSD為0.34%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

表1 格列本脲加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫放置，分別于 0，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果的 RSD為0.50%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ，批次編號(hào)為1）內(nèi)容物20粒，研細(xì)，分別精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于格列本脲5 mg），置25 mL容量瓶中，分別精密加入對(duì)照品約4，5，6 mg，各3份，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。分別精密量取續(xù)濾液5 mL，置9個(gè)100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算格列本脲的加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ），依法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，記錄定量離子離子流色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批次編號(hào)為1，2，3樣品的含量分別為標(biāo)示量的97.53%，98.30%，98.22%。

3 討論

3.1 色譜及質(zhì)譜條件選擇

本研究中還分別考察了0.02 mol／L乙酸銨-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈等流動(dòng)相組成，結(jié)果流動(dòng)相甲醇-0.1%甲酸水（40∶60）的理論板數(shù)最高、質(zhì)譜響應(yīng)值最高，理論板數(shù)均可達(dá)6 000以上，因此采用該流動(dòng)相系統(tǒng)作為檢測(cè)條件。在對(duì)二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，格列本脲得到了穩(wěn)定的碎片離子。

3.2 各國(guó)藥典比較

中國(guó)藥典[12]1117、歐洲藥典、英國(guó)藥典、日本藥典收載的格列本脲含量測(cè)定方法為HPLC法和滴定法，HPLC法流動(dòng)相分別為磷酸二氫銨溶液（取磷酸二氫銨1.725 g，加水300 mL溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5）-甲醇（3∶5），1.36%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（53∶47），由于液質(zhì)聯(lián)用法只可以揮發(fā)性成分作流動(dòng)相，因此該系統(tǒng)不適用于液質(zhì)聯(lián)用法。與各國(guó)藥典方法相比，本研究中建立的方法適用于液質(zhì)聯(lián)用法

分析格列本脲的含量，定量限也更低，因此能更準(zhǔn)確、靈敏、專屬地檢測(cè)格列本脲的含量。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了適合二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲含量的色譜系統(tǒng)與質(zhì)譜系統(tǒng)，為格列本脲復(fù)方制劑的分析開發(fā)了新的條件，且該系統(tǒng)適用于質(zhì)譜檢測(cè)，能為HPLC-MS／MS法對(duì)該藥品的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析等提供參考。

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ContentDetermination ofGlibenclamide in Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）by HPLC-M S／M S

Liu Xinkui1，Wang Mengmeng2，Zhang Liancheng1，Wang Chaozhong1
（1.Insepection and Testing Center of Qiqihar Institute for Food and Drug Control，Qiqihar，Heilongjiang，China 161005； 2.Department of Integrated Chinese and Western Medicine，The First Hospital of Qiqihar，Qiqihar，Heilongjiang，China 161005）

Objective To establish an HPLC-MS／MS method for the content determination of glibenclamide in Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）.M ethods The HPLC-MS／MS instrument was used.The samples were carried out on the Waters Atlantis T3 C18column（100 mm×2.1 mm，3 μm）.The mobile phase was composed of methanol-0.1% formic acid water（40∶60）at a flow rate of 0.2 mL／min.The column temperature was 30℃.The detection was performed with MRM using electrospray ionization（ESI）.Results A good linearity of glibenclamide was obtained in the range of 1.011-30.33 μg／mL（r＝0.999 7）.The recovery rate was 99.09%，RSD＝1.55%（n＝9），and the stability was good.Conclusion This method is fast，sufficiently selective and sensitive which provides an analytical basis for the quality control of Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）.

HPLC-MS／MS；Metformin Hydrochloride and Glibenclamide Capsules（Ⅰ）；glibenclamide；content；quality control

R927.2；R977.1+5

A

1006-4931(2017)06-0025-03

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.007

劉信奎，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量控制，（電話）0452-2798917。

△通訊作者：王超眾，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量控制，（電子信箱）wangchaozhongkcn＠163.com。