馮 琛，湯浩茹，江雷雨，宋 霞，張?jiān)奇?，葉云天，陳 清，孫 勃

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 四川 成都 611130)

紅藍(lán)光對(duì)草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因密碼子使用偏好性的影響

馮 琛，湯浩茹*，江雷雨，宋 霞，張?jiān)奇?，葉云天，陳 清，孫 勃

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 四川 成都 611130)

草莓轉(zhuǎn)錄組中特異表達(dá)基因密碼子的使用偏好性分析能夠?yàn)榛虍愒幢磉_(dá)提供參考。為了探究紅藍(lán)光處理對(duì)草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因密碼子使用偏好性的影響，以四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期紅藍(lán)光處理后的草莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以白光處理的草莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為原始對(duì)照數(shù)據(jù)，利用perl語言及測(cè)序結(jié)果中的FPKM值(fragments per kb per million fragments)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，通過Mobyle在線程序?qū)Y選得到的特異表達(dá)基因進(jìn)行密碼子偏好性分析。結(jié)果表明：藍(lán)光處理后的特異表達(dá)基因有114條，大約是紅光處理的2倍；從GC含量結(jié)合GC3s含量來看，紅光和藍(lán)光處理中的特異表達(dá)基因各自均有91%偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子；最優(yōu)密碼子中，紅光特異基因偏好以A/T結(jié)尾的最優(yōu)密碼子所占的比例比藍(lán)光特異基因多2.84%；密碼子使用頻率比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母表達(dá)系統(tǒng)更適合用于2種處理特異表達(dá)基因的異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，擬南芥更適合作為2種處理特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因受體。

紅藍(lán)光；轉(zhuǎn)錄組；草莓；密碼子偏好性

承載物種遺傳信息的DNA所編碼的蛋白質(zhì)都是由氨基酸組成的，自然界中共有64個(gè)密碼子編碼這些氨基酸，同一種氨基酸(起始密碼子、終止密碼子，色氨酸除外)可能由不同種同義密碼子編碼[1]。物種在不斷進(jìn)化的過程中，會(huì)出現(xiàn)對(duì)密碼子不平衡選擇的現(xiàn)象，即密碼子使用偏好性(codon usage bias)。對(duì)這一特定現(xiàn)象的深入分析，能夠幫助我們了解物種的發(fā)展過程、進(jìn)化規(guī)律、突變方式[2-3]，有利于初步預(yù)測(cè)基因的表達(dá)水平，為密碼子優(yōu)化奠定基礎(chǔ)[4]；同時(shí)，也有助于我們尋找基因的最適外源表達(dá)宿主等[5-6]。目前，有關(guān)密碼子使用偏好性的研究已經(jīng)越來越多，不僅僅局限于某個(gè)物種的單一基因、某基因家族或轉(zhuǎn)錄組[7-9]，不同的物種之間同一基因或基因家族、轉(zhuǎn)錄組或基因組密碼子使用偏好比較分析的研究也逐漸增多[10-12]。

植物生長發(fā)育過程中，光質(zhì)是一個(gè)很重要的調(diào)節(jié)因素[13]。許多研究證明，可以通過改變光質(zhì)來調(diào)節(jié)植物的光合作用[14]、成熟衰老[15]、抗逆生長[16]等過程。目前，光質(zhì)在草莓(Fragaria×ananassa)上的研究主要集中在生理生化(如改善果實(shí)品質(zhì))以及基因功能驗(yàn)證方面[17-19]，而在基因大數(shù)據(jù)層面上，如新基因的挖掘、密碼子偏好性分析等還鮮見報(bào)道。本課題組前期對(duì)豐香草莓進(jìn)行了不同光質(zhì)的處理[20]，獲得了不同處理下的果實(shí)，并對(duì)其進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)。本文利用果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了不同處理下特異表達(dá)基因的密碼子分析，以期為后期新基因功能的驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)來源

不同光質(zhì)處理后的草莓品種豐香成熟果實(shí)材料[20]，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，課題組于2016年3月完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析。以拼接好的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù)，為降低取樣誤差，利用perl語言程序(編碼序列長度≥300 bp，以ATG為起始密碼子，以TAA、TAG或TGA為終止密碼子且序列中間無終止密碼子)提取用于初步分析的CDS(coding sequence)序列。為獲得不同光質(zhì)處理的特異表達(dá)基因，利用測(cè)序報(bào)告中提供的FPKM值對(duì)得到的初步結(jié)果進(jìn)行二次篩選，其中，F(xiàn)PKM≥1定義為高表達(dá)，<1為低表達(dá)或不表達(dá)。

1.2 密碼子使用偏好性分析

利用Mobyle在線程序CodonW和CUSP(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py？#f orms::CodonW/CUSP)對(duì)每條CDS序列的密碼子進(jìn)行分析，參數(shù)包括：第3位上相對(duì)堿基的出現(xiàn)頻率(A3s/T3s/G3s/C3s)、第1/2/3位的GC含量(GC1/2/3s)、GC含量(GC)、有效密碼子數(shù)(effective number of codons，ENc)、同義密碼子相對(duì)使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)、密碼子偏愛指數(shù)(codon bias index，CBI)、密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation，CAI)等。以GC3s為橫坐標(biāo)，GC1/2s為縱坐標(biāo)，繪制衡量選擇與突變對(duì)密碼子使用模式影響程度的中性繪圖(neutrality plots)。在計(jì)算第3位密碼子核苷酸含量基礎(chǔ)上，分別計(jì)算A3/(A3+U3)與G3/(G3+C3)值，并以G3/(G3+C3)為橫坐標(biāo)，A3/(A3+U3)為縱坐標(biāo)，繪制PR2(Parity Rule 2)圖。

ENc值與GC3s的相關(guān)性又稱為ENc繪圖分析，以密碼子第3位上的GC含量為橫坐標(biāo)，ENc值為縱坐標(biāo)，被廣泛用于分析影響密碼子使用的主要因素。若位于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近的基因比較多，則說明該基因的密碼子偏好性受堿基組成(即突變作用)影響比較大；反之，說明密碼子偏好性受選擇作用比較大。

1.3 最優(yōu)密碼子確定

為了更精準(zhǔn)地確定最優(yōu)密碼子，本研究采用了高頻優(yōu)越密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子相結(jié)合的辦法。高頻優(yōu)越密碼子以同義密碼子出現(xiàn)次數(shù)的多少為選擇標(biāo)準(zhǔn)；高表達(dá)優(yōu)越密碼子以ENc值為偏性標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算ENc值前后各10%的2組基因中每個(gè)基因密碼子的RSCU值，相同密碼子RSCU的差值大于0.08的為最優(yōu)密碼子。

1.4 受體系統(tǒng)比較

密碼子使用頻率的比值多用來反映物種間密碼子使用偏好性的差異。一般認(rèn)為比值≤0.5或者≥2時(shí)物種間的密碼子使用偏好性差異較大。為了確定適合表達(dá)的異源宿主，將得到的基因密碼子使用頻率與常用的異源宿主(包括大腸埃希菌、酵母菌、擬南芥、煙草、小麥、玉米)的密碼子使用頻率(從密碼子使用數(shù)據(jù)庫上獲得，http://www.kazusa.or.jp/codon)進(jìn)行比較。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Mobyle在線程序中CodonW和CUSP計(jì)算所有基因序列堿基組成和密碼子偏好性指標(biāo)，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行相關(guān)性和差異顯著性分析，利用EXCEL 2016繪制相關(guān)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列篩選及密碼子偏好性參數(shù)分析

通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行紅藍(lán)光篩選后發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光處理后的特異表達(dá)基因有114個(gè)，大約是紅光處理(56個(gè))的2倍。對(duì)這些基因進(jìn)行密碼子偏好性參數(shù)分析，結(jié)果(表1)表明，紅光處理后的特異表達(dá)基因中，GC含量變化范圍為39%～53%，其中大于50%的僅有5條序列，同時(shí)，這一處理中全部特異表達(dá)基因的GC3s含量為44%，表明紅光處理下的特異表達(dá)基因偏好使用以A或T結(jié)尾的密碼子；藍(lán)光處理下，114條序列的GC含量從40%變化到57%，其中大于50%的有10條，全部特異表達(dá)基因的GC3s含量為46%，說明藍(lán)光處理下的特異表達(dá)基因也偏好使用以A或T結(jié)尾的密碼子。

對(duì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行中性繪圖分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，紅光處理下GC12s和GC3s的相關(guān)系數(shù)為0.172，雙尾檢驗(yàn)未達(dá)顯著水平，說明此處理下密

表1 紅藍(lán)光處理下草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因的密碼子組成及使用偏好性參數(shù)

Table 1 Composition and codon usage bias of specific genes in strawberry transcriptome under the red and blue light

密碼子組成和使用參數(shù)Compositionandcodonusagebias紅光處理Redlighttreatment變化范圍Range平均數(shù)Average標(biāo)準(zhǔn)差Standarddeviation藍(lán)光處理Bluelighttreatment變化范圍Range平均數(shù)Average標(biāo)準(zhǔn)差Standarddevia-tionT3s0.25～0.480.390.050.18～0.500.390.06C3s0.15～0.430.260.060.15～0.530.270.06A3s0.20～0.400.320.050.14～0.440.310.06G3s0.19～0.440.280.050.18～0.550.300.06CAI0.16～0.280.200.020.15～0.310.200.02CBI-0.15～0.11-0.050.06-0.18～0.13-0.050.06ENc44.81～59.0353.443.1647.16～59.1153.582.82GC0.39～0.530.450.030.40～0.570.450.03GC1s0.42～0.570.500.030.40～0.600.500.04GC2s0.31～0.500.400.040.30～0.540.400.41GC3s0.33～0.610.440.060.35～0.730.460.07L_sym289～1210563.84214.21288～2450531.71305.72L_aa306～1262586.79221.01304～2544552.68316.44Gravy-0.87～0.70-0.210.38-1.97～0.66-0.270.37Aromo0.04～0.150.090.020.03～0.160.080.03FOP0.33～0.490.390.040.31～0.490.390.03

T3s，密碼子在第3位的胸腺嘧啶含量；C3s，密碼子在第3位的胞嘧啶含量；A3s，密碼子在第3位的腺嘌呤含量；G3s，密碼子在第3位的鳥嘌呤含量；CAI，密碼子適應(yīng)指數(shù)；CBI，密碼子偏好指數(shù)；ENc，有效密碼子數(shù)；GC，鳥嘌呤+胞嘧啶含量；GC1s，密碼子第1位的G+C含量；GC2s，密碼子第2位的G+C含量；GC3s，密碼子第3位的G+C含量；L_sym，同義氨基酸數(shù)；L_aa，氨基酸序列的長度；Gravy，平均親水性值；Aromo，芳香族氨基酸頻率；FOP，最優(yōu)密碼子使用頻率。

T3s， content of thymine at the third nucleotide of a codon; C3s， content of cytosine at the third nucleotide of a codon; A3s， content of adenine at the third nucleotide of a codon; G3s， content of guanine at the third nucleotide of a codon; CAI， codon adaptation; CBI， codon bias index; ENc， effective number of codons; GC， content of guanine and cytosine; GC1s， content of guanine and cytosine at the first nucleotide of a codon; GC2s， content of guanine and cytosine at the second nucleotide of a codon; GC3s， content of guanine and cytosine at the third nucleotide of a codon; L_sym， synonymous amino acids; L_aa， length of amino acid sequence; Gravy， hydrophobic average; Aromo， aromaticity; FOP， frequency of optimal codons.

碼子偏好性受選擇作用影響較大；藍(lán)光處理下GC12s和GC3s的相關(guān)系數(shù)為0.195，雙尾檢驗(yàn)達(dá)顯著水平，說明此處理下受突變作用影響較大。

PR2繪圖結(jié)果(圖2)表明，紅光和藍(lán)光處理下密碼子第3位T的使用頻率均高于A，G使用頻率均高于C，4個(gè)堿基的不均衡使用表明這2個(gè)處理下基因密碼子偏好性除受突變壓力影響外，還受選擇作用等因素的影響。

由ENc-GC3s plot分析圖(圖3)可知，紅光處理下大部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，只有少部分基因分布在距離曲線較近的位置，表明此處理中基因的密碼子偏好性主要受選擇作用的影響；藍(lán)光處理下多數(shù)基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，表明此處理中基因的密碼子偏好性除受到突變壓力影響外，還受到選擇作用等因素的影響。

2.2 最優(yōu)密碼子確定

以同義密碼子出現(xiàn)的多少，確定了GCT、TGT等21個(gè)密碼子為紅光處理特異表達(dá)基因的高頻優(yōu)越密碼子(表2)，GCT、TGC等21個(gè)密碼子為藍(lán)光處理特異表達(dá)基因的高頻優(yōu)越密碼子(表3)；根據(jù)高、低基因表達(dá)組的RSCU值之差，確定了GCT、GCG等51個(gè)密碼子，GCA、GCC等39個(gè)密碼子分別為紅光和藍(lán)光處理特異表達(dá)基因的高表達(dá)優(yōu)越密碼子。通過上述2種方法，最終確定GCT、TGT等共計(jì)16個(gè)為紅光處理特異表達(dá)基因的最優(yōu)密碼子，GCT、TTT等共計(jì)11個(gè)為藍(lán)光處理特異表達(dá)基因的最優(yōu)密碼子。紅藍(lán)光2種處理下特異表達(dá)基因的最優(yōu)密碼子分別有93.75%、90.91%偏愛以A或T結(jié)尾。

a，紅光處理；b，藍(lán)光處理a， Red light treatment; b， Blue light treatment圖1 中性繪圖(GC12s vs. GC3s)Fig.1 Neutrality plot (GC12s vs. GC3s)

a，紅光處理；b，藍(lán)光處理。灰色圓圈表示每個(gè)點(diǎn)平均分布位置；a值為x=0.52616579561±0.0746123231，y=0.45179773266±0.0473135499；b值為x=0.5317688611±0.0664334405，y=0.4448534344±0.0527922866a， Red light treatment; b， Blue light treatment. Grey open circle indicated the average position for each plot; a calculated as follows: x=0.52616579561±0.0746123231， y=0.45179773266±0.0473135499; b calculated as follows: x=0.5317688611±0.0664334405， y=0.4448534344±0.0527922866圖2 PR2 繪圖[(A3/(A3+T3) vs. G3/(G3+C3)]Fig.2 PR2-bias plot [A3/(A3+T3) against G3/(G3+C3)]

2.3 受體系統(tǒng)的選擇

基因的異源表達(dá)是轉(zhuǎn)基因研究的重要部分，合適的受體是轉(zhuǎn)基因高效表達(dá)的必要條件之一。如果基因含有較多的與受體表達(dá)系統(tǒng)差異較大的稀有密碼子，可能就會(huì)造成基因在該受體中表達(dá)量低甚至無法表達(dá)，不利于研究。為了探明這些特異基因的功能，本研究將紅藍(lán)光處理的特異表達(dá)基因與常見受體系統(tǒng)的密碼子使用頻率進(jìn)行了比較(表4)。結(jié)果顯示，紅光處理的特異基因與擬南芥、煙草這2種雙子葉植物的密碼子使用頻率比值中，≤0.5或≥2.0的分別有1、2種；與單子葉植物小麥、玉米的密碼子使用頻率比值中，≤0.5或≥2.0的分別有23、8種；藍(lán)光處理特異基因與這4種植物的密碼子使用頻率比值中，≤0.5或≥2.0的分別有0、2、18、9種。上述結(jié)果說明雖然2種處理特異表達(dá)基因與4個(gè)物種的密碼子使用偏好存在差異，但與雙子葉植物的差異明顯比與單子葉植物小，且擬南芥更適合作為2種處理特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因受體。

為了解紅藍(lán)光處理特異表達(dá)基因在真核和原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)情況，分別選取了酵母菌和大腸埃希菌作為代表。結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)，紅光處理特異基因與大腸埃希菌、酵母的密碼子使用頻率比值中，≤0.5或≥2.0的分別有27、5個(gè)；藍(lán)光處理特異表達(dá)基因與這2種表達(dá)系統(tǒng)的使用頻率比值中，≤0.5或≥2.0的分別有25、6個(gè)。這一結(jié)果說明，對(duì)紅藍(lán)光處理特異表達(dá)基因而言，酵母表達(dá)系統(tǒng)可能要優(yōu)于大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)。

a，紅光處理；b藍(lán)光處理a， Red light treatment; b， Blue light treatment圖3 ENc-GC3s繪圖Fig.3 ENc-GC3s plot

表2 紅光處理下草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因同義密碼子相對(duì)使用度

Table 2 The RSCU of specific genes in strawberry transcriptome under the red light

密碼子Codon氨基酸Acid同義密碼子相對(duì)使用度RSCU高表達(dá)Highexpression低表達(dá)Lowexpression密碼子Codon氨基酸Acid同義密碼子相對(duì)使用度RSCU高表達(dá)Highexpression低表達(dá)Lowexpression密碼子Codon氨基酸Acid同義密碼子相對(duì)使用度RSCU高表達(dá)Highexpression低表達(dá)LowexpressionGCA#Ala0.941.64AAGLys1.131.10AGC#Ser0.881.03GCC#Ala1.040.58CTA#Leu0.860.55AGT#Ser1.010.80GCG#Ala0.740.04CTC#Leu1.150.48TCA#Ser0.941.89GCT#Ala1.281.74CTG#Leu0.721.27TCC#Ser1.350.51TGC#Cys0.970.78CTT#Leu1.411.61TCG#Ser0.660.17TGT#Cys1.031.22TTA#Leu0.530.67TCT#Ser1.171.59GAC#Asp0.890.67TTG#Leu1.321.41ACA#Thr1.211.37GATAsp1.271.33ATGMet1.001.00ACCThr1.031.04GAA#Glu0.841.15AAC#Asn1.220.92ACG#Thr0.840.24GAG#Glu1.160.85AAT#Asn0.781.08ACT#Thr0.881.35TTC#Phe1.030.65CCA#Pro1.461.94GTA#Val0.360.50TTT#Phe0.971.35CCCAsn0.390.40GTC#Val0.970.63GGAGly1.251.24CCG#Asn1.170.02GTGVal1.201.26GGC#Gly0.600.50CCT#Asn0.981.29GTT#Val1.471.61GGG#Gly0.911.02CAA#Gln1.070.91TGGTrp1.001.00GGTGly1.241.24CAGGln0.930.89TAC#Tyr1.040.51CAC#His0.870.53AGA#Arg1.672.86TAT#Tyr0.961.49CAT#His1.131.47AGG#Arg1.311.79TAA#*TER1.800.60ATA#Ile0.950.83CGA#Arg0.850.37TAG*TER0.600.60ATC#Ile1.000.61CGC#Arg0.930.19TGA#*TER0.601.80ATT#Ile1.061.56CGG#Arg0.800.32AAALys0.870.90CGTArg0.440.47

“#”表示高表達(dá)優(yōu)越密碼子；下劃線表示高頻優(yōu)越密碼子。下同。

“#” meant codon usage with high expression; The underlined data meant codon usage with high frequency. The same as the bellow.

表3 藍(lán)光處理下草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因同義密碼子相對(duì)使用度

Table 3 The RSCU of specific genes in strawberry transcriptome under the blue light

密碼子Codon氨基酸Acid同義密碼子相對(duì)使用度RSCU高表達(dá)Highexpression低表達(dá)Lowexpression密碼子Codon氨基酸Acid同義密碼子相對(duì)使用度RSCU高表達(dá)Highexpression低表達(dá)Lowexpression密碼子Codon氨基酸Acid同義密碼子相對(duì)使用度RSCU高表達(dá)Highexpression低表達(dá)LowexpressionGCA#Ala1.161.30AAGLys1.111.12AGCSer0.900.84GCC#Ala0.940.63CTALeu0.500.51AGT#Ser1.011.15GCG#Ala0.620.45CTC#Leu0.941.04TCA#Ser1.121.48GCT#Ala1.281.63CTG#Leu1.080.88TCC#Ser0.900.80TGCCys0.991.04CTT#Leu1.411.12TCG#Ser0.750.37TGTCys1.010.96TTALeu0.670.67TCTSer1.311.36GACAsp0.590.62TTG#Leu1.401.78ACA#Thr1.191.40GATAsp1.411.38ATGMet1.001.00ACC#Thr1.000.77GAAGlu1.041.00AACAsn0.800.83ACG#Thr0.540.37GAGGlu0.961.00AATAsn1.201.17ACT#Thr1.281.47TTC#Phe0.940.78CCA#Pro1.231.48GTAVal0.490.53TTT#Phe1.061.22CCCPro0.690.64GTCVal0.770.77GGA#Gly1.421.20CCG#Pro0.840.50GTG#Val1.251.16GGC#Gly0.770.59CCT#Pro1.241.37GTTVal1.491.54GGGGly0.790.83CAAGln1.041.06TGGTrp1.001.00GGT#Gly1.011.14CAGGln0.960.94TAC#Tyr0.790.88CAC#His1.070.75AGA#Arg1.892.44TAT#Tyr1.211.12CAT#His0.931.20AGG#Arg1.352.10TAA#*TER0.650.27ATAIle0.570.60CGA#Arg0.940.40TAG#*TER0.901.64ATC#Ile1.040.86CGCArg0.350.41TGA#*TER1.451.09ATT#Ile1.391.55CGG#Arg0.650.36AAALys0.890.88CGT#Arg0.810.28

表4 紅藍(lán)光處理下草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因與6個(gè)物種基因組的密碼子頻率比值

Table 4 Codon frequency ratios of specific genes in strawberry transcriptome under the red/light and 6 heterologous host genomes

密碼子Genecode氨基酸Aminoacid紅光處理RedlighttreatmentC/EC/YC/AC/NC/TC/Z藍(lán)光處理BluelighttreatmentC/EC/YC/AC/NC/TC/ZGCAAla1.051.471.270.971.441.330.951.331.140.871.301.20GCCAla0.390.741.190.950.370.390.410.791.271.010.400.42GCGAla0.151.460.631.220.260.250.171.720.741.430.300.29GCTAla2.320.860.880.721.511.182.200.820.830.681.441.12TGCCys1.112.021.231.180.650.731.222.221.351.300.720.80TGTCys1.701.300.951.151.971.791.631.250.911.101.881.71GACAsp0.820.650.981.040.580.530.870.691.041.100.620.56GATAsp0.850.900.880.901.881.400.941.000.971.002.081.56GAAGlu0.750.870.950.912.131.640.740.860.940.902.111.62GAGGlu1.601.020.921.060.770.721.711.080.981.130.820.77TTCPhe1.320.960.961.140.800.791.250.910.911.080.760.75TTTPhe1.241.021.121.041.991.951.130.931.020.951.821.77GGAGly2.251.080.860.795.601.552.221.070.840.785.511.52GGCGly0.331.351.190.770.440.360.341.421.250.800.460.38GGGGly1.482.201.251.140.710.831.502.221.261.150.720.83GGTGly0.860.710.820.581.331.290.850.710.820.571.331.29CACHis0.721.031.081.080.680.630.680.971.021.020.640.59CATHis0.951.271.091.391.781.480.961.291.101.411.811.51ATAIle3.651.221.071.272.011.613.721.241.091.302.051.64ATCIle0.820.770.811.080.620.660.860.810.851.130.640.69ATTIle0.820.801.160.952.131.800.830.821.180.972.171.84

續(xù)表4

下劃線表示2個(gè)物種密碼子比較具有明顯偏差(≤0.5，≥2)；C/E、C/Y、C/A、C/N、C/T、C/Z分別代表與大腸埃希菌、酵母菌、擬南芥、煙草、小麥、玉米的比值。

The underlined data meant the codon obvious difference was found between the two species (≤ 0.5， ≥ 2); C/E， C/Y， C/A， C/N， C/T， C/Z represent codon frequency ratios withEscherichiacoli，Pichiapastoris，Arabidopsisthaliana，Nicotianatobacum，Triticumaestivum，Zeamays.

3 討論

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光處理的特異表達(dá)基因數(shù)量是紅光處理的2倍，說明藍(lán)光處理可能誘導(dǎo)了更多新基因的表達(dá)。利用Mobyle在線程序?qū)虻拿艽a子組成及使用偏好分析發(fā)現(xiàn)，紅藍(lán)光處理下的特異表達(dá)基因的平均GC含量以及平均GC3s含量均小于0.5，說明這2種處理下的特異基因整體A/T含量高于G/C含量，且偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子，這一特性符合雙子葉植物的密碼子偏好特性[21]。PR2-plot分析發(fā)現(xiàn)，A、C、T、G 4個(gè)堿基使用不平衡，結(jié)合中性繪圖與ENc-plot綜合分析，紅藍(lán)光處理下特異表達(dá)基因均受到突變和選擇等多重因素的影響，且紅光處理下的特異表達(dá)基因受選擇作用高一些，而藍(lán)光處理下的則受突變作用多一些，這可能是造成藍(lán)光處理有更多新基因表達(dá)的原因之一。

最優(yōu)密碼子的分析可以利用多種方法來進(jìn)行，目前多數(shù)研究偏好于使用高低表達(dá)基因的RSCU差值來確定最優(yōu)密碼子[22-25]。本研究在利用這種方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合了“同義密碼子使用頻率的高低”這一判斷標(biāo)準(zhǔn)，最終確定了紅藍(lán)光處理下的最優(yōu)密碼子。在這2種處理的最優(yōu)密碼子中以GC結(jié)尾的均各有1個(gè)，這一結(jié)果與平均GC含量以及平均GC3s含量所得出的結(jié)果一致。藍(lán)光處理下的最優(yōu)密碼子的數(shù)量少于紅光處理，這可能是由紅光處理下特異表達(dá)基因的數(shù)量偏小造成的。

進(jìn)行外源基因的異源表達(dá)時(shí)，外源基因與受體系統(tǒng)的密碼子使用特性分析往往起著非常重要的作用，為了提高外源基因的表達(dá)效率，往往需要對(duì)外源基因的堿基序列進(jìn)行一定的修飾[26]。本研究中，2種光處理下特異基因與常見的表達(dá)系統(tǒng)密碼子使用特性分析發(fā)現(xiàn)，酵母菌表達(dá)系統(tǒng)可能更適合這2種光處理下特異基因的表達(dá)；雙子葉植物擬南芥、煙草可能更適合作為2種光處理特異基因的轉(zhuǎn)基因受體。但外源基因能否高效表達(dá)，除了密碼子偏好特性的影響，還受轉(zhuǎn)化效率等影響[27]。

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(責(zé)任編輯 侯春曉)

Analysis of codon usage bias of specific genes in strawberry transcriptome under the red and blue light

FENG Chen， TANG Haoru*， JIANG Leiyu， SONG Xia， ZHANG Yunting， YE Yuntian， CHEN Qing， SUN Bo

(CollegeofHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Analysis of codon usage bias of specific genes in strawberry transcriptome could provide reference for heterologous expression of genes. To understand the influence of red and blue light on codon usage bias， the original experimental data， which was transcriptome of strawberry treated with red and blue light， and the original control data， which was transcriptome of strawberry treated with white light， were screened by perl language and FPKM (fragments per kb per million fragments) value， then， Mobyle online program were used to analyze the codon usage bias of it. The results showed that there were 114 specific genes under the blue light， twice as that under the red light; From the point of view of GC content combined with GC3s (GC content of the third position)， 91 percent of specific genes under red and blue light， respectively， were bias toward the synonymous codons with A and T at the third codon position; In addition， the fraction of specific genes under the red light between optimal codons with A and T at the third codon position and optimal codons was 2.84 percent more than that under the blue light. According to codon usage frequency， thePichiapastorisexpression system was more suitable for heterologous expression of specific genes of the two treatments，Arabidopsisthalianamight be the best receptor for transgenosis.

red and blue light; transcriptome; strawberry; codon usage bias

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.08

2016-12-06

馮琛(1992—)，男，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)在果樹上的應(yīng)用研究。E-mail: fengchensicau@163.com

*通信作者，湯浩茹，E-mail: htang@sicau.edu.cn

S432.4+1

A

1004-1524(2017)04-0566-09

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 566-574

馮琛， 湯浩茹， 江雷雨， 等. 紅藍(lán)光對(duì)草莓轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)基因密碼子使用偏好性的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 29(4): 566-574.