天祝白牦牛MSTN基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

張 麗，劉麗霞，李強(qiáng)子，陳 紅

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

天祝白牦牛MSTN基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

張 麗，劉麗霞，李強(qiáng)子，陳 紅

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

為探討天祝白牦牛MSTN基因的分子結(jié)構(gòu)特征，通過PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)以及生物信息學(xué)分析工具對(duì)天祝白牦牛MSTN基因進(jìn)行克隆、測序及相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，天祝白牦牛MSTN基因編碼區(qū)序列全長1 128 bp，編碼375個(gè)氨基酸殘基；天祝白牦牛MSTN基因編碼蛋白分子量42.55 ku，理論等電點(diǎn)為6.14；生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，天祝白牦牛MSTN蛋白是不穩(wěn)定的親水蛋白，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能為-1 135.16 kJ·mol-1，蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)均是以無規(guī)卷曲和延伸鏈為主的混合型蛋白。天祝白牦牛MSTN基因的成功克隆為進(jìn)一步研究牦牛MSTN的遺傳特性和生理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

天祝白牦牛；MSTN基因；克??；生物信息學(xué)

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)基因是控制牛肌肉生長和瘦肉率的主效基因[1]。該基因?qū)儆谵D(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)超家族成員之一，廣泛分布于動(dòng)物體內(nèi)。MSTN基因首先在小鼠骨骼肌cDNA文庫中被克隆出來，屬骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子，主要通過抑制MyoD家族成員的轉(zhuǎn)錄活性負(fù)向調(diào)控肌細(xì)胞的生長發(fā)育，它的表達(dá)量與肌肉質(zhì)量的變化呈負(fù)相關(guān)[2]。比利時(shí)藍(lán)牛和皮爾蒙特牛的“雙肌性狀”是由于MSTN基因第1外顯子和第3外顯子上的兩個(gè)堿基突變導(dǎo)致蛋白活性區(qū)的移碼突變，不能形成成熟的MSTN蛋白，從而使脂肪不增加而體重增加[3]。目前已克隆出魚[4]、雞[5]、鹿[6]、馬[7]、貂[8]、羊[9]、豬[10]、普通牛[11]和甘南牦牛[12]等動(dòng)物的MSTN基因，但主要集中在畜禽的多態(tài)性研究上，有關(guān)天祝白牦牛MSTN基因編碼蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能的研究未見報(bào)道。

天祝白牦牛主要分布在甘肅天祝藏族自治縣境內(nèi)海拔2 040～4 874 m的高山、亞高山地區(qū)，為牧區(qū)人民提供肉、乳、毛等生產(chǎn)生活必需品，是我國乃至世界稀有而寶貴的畜禽種質(zhì)資源。為深入探討牦牛MSTN基因的性質(zhì)和功能，避免人工選育和該基因演化造成的差異，本研究利用生物信息學(xué)方法從分子水平對(duì)天祝白牦牛MSTN基因序列結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物信息學(xué)特征進(jìn)行預(yù)測和分析，為揭示該基因理化性質(zhì)、功能信息、遺傳特性、相關(guān)生理機(jī)制，及其與生長發(fā)育和肉品質(zhì)性狀的相關(guān)性等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘肅省天祝縣屠宰場采集白牦牛血樣71份，醫(yī)用采血管保存。采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法進(jìn)行基因組DNA提取，去離子水溶解稀釋。牦牛DNA母液各取5 μL構(gòu)建DNA混合池，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中的甘南牦牛MSTN基因序列(GenBank No. EU926670)，利用Primer6.0和SelectPrimer軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物擴(kuò)增DNA混合池(表1)，引物由上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增和克隆測序

PCR擴(kuò)增體系總體積為40 μL∶DNA模板2.0 μL，0.25 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR MasterMix 22.0 μL，三蒸水14 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4℃保存，采用1%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后在4 ℃條件下和T載體連接過夜，將重組載體導(dǎo)入CaCl2處理的DH5α細(xì)胞，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)12～14 h，挑取陽性菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，結(jié)束后將克隆菌液送至北京華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAStar、MegAlign和Editseq軟件比對(duì)和拼接獲得天祝白牦牛MSTN基因編碼區(qū)序列。

1.4 生物信息學(xué)分析工具

對(duì)天祝白牦牛MSTN基因編碼區(qū)生物信息學(xué)分析按照參考文獻(xiàn)[13-14]介紹的在線軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 天祝白牦牛MSTN基因PCR分段擴(kuò)增結(jié)果

天祝白牦牛MSTN基因PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，特異性良好，片段大小與預(yù)期擴(kuò)增片段相符。

2.2 天祝白牦牛MSTN基因序列測定、序列拼接和一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

克隆測序結(jié)果表明，P1、P2及P3引物擴(kuò)增產(chǎn)物分別為575、560和593 bp，測序結(jié)果良好。利用Seqman 和MegAlign軟件對(duì)三段序列手動(dòng)校對(duì)、剪切、拼接獲得天祝白牦牛MSTN基因序列。

表1 引物信息

Table 1 The information of primers

引物名稱Primername引物序列(5’-3’)Primersequence擴(kuò)增區(qū)域Amplifiedregions目的片段長度/bpProductsize/bpP15’-TGGCTTGGCGTTACTCAAAAGCA-3’Exon15755’-CTCCTCCTTACATACAAGCCAGCAGC-3’P25’-TGTTCATAGATTGATAGGAGGTGTTCG-3’Exon25605’-AATAAGCACAGGAAACTGGTAGTTATTT-3’P35’-AAGAAATGTGACATAAGCAAAATGATTAGT-3’Exon35935’-CATACTCTAGGCTTATAGCCTGTGGTA-3’

M： DNA MarkerⅢ；1～3： P1引物擴(kuò)增產(chǎn)物；4～6： P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物；7～9： P3引物擴(kuò)增產(chǎn)物M: DNA MarkerⅢ; 1-3: Amplified products of first segment; 4-6: Amplified products of second segment; 7-9: Amplified products of third segment圖1 天祝白牦牛MSTN基因P1、P2及P3引物擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖檢測Fig.1 Amplifications of MSTN gene from P1, P2 and P3 primers in Tianzhu white yak

以GenBank中甘南牦牛及普通牛的MSTN基因序列為參照，結(jié)合“Kozak規(guī)則”[15]確定各外顯子位置及大小。結(jié)果表明，擴(kuò)增出天祝白牦牛MSTN基因3個(gè)外顯子大小分別為373、374和381 bp。天祝白牦牛與甘南牦牛MSTN基因編碼區(qū)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)c.417C>T的堿基突變。

利用EditSeq和GeneGuest軟件對(duì)天祝白牦牛MSTN基因中編碼區(qū)組成及其序列結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)天祝白牦牛MSTN基因編碼區(qū)G+C含量(43.44%)低于A+T含量(56.56%)。

2.3 天祝白牦牛MSTN基因開放閱讀框分析

開放閱讀框(open reading frame，ORF)是DNA上的一段堿基序列，有完整的起始密碼子和終止密碼子序列，因而編碼一個(gè)蛋白[16]。DNA序列按 6種框架閱讀和翻譯(每條鏈3種，對(duì)應(yīng)3種不同的起始密碼子)。ORF識(shí)別包括檢測這6個(gè)閱讀框架并決定哪一個(gè)包含以啟動(dòng)子和終止子為界限的 DNA 序列而其內(nèi)部不包含啟動(dòng)子或密碼子，符合這些條件的序列有可能對(duì)應(yīng)一個(gè)真正的單一的基因產(chǎn)物。ORF的識(shí)別是證明一個(gè)DNA序列為特定的蛋白質(zhì)編碼基因的部分或全部的先決條件。本研究應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序預(yù)測得到的氨基酸產(chǎn)物在Pfam軟件中分析比對(duì)，并參照Kozak法則[17]，獲得長792 bp的ORF(圖2)，起始密碼子ATG位于+134，終止密碼子TGA位于+1260，推測天祝白牦牛MSTN基因編碼375個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

2.4 天祝白牦牛MSTN編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點(diǎn)等[18]。利用在線軟件預(yù)測天祝白牦牛MSTN編碼蛋白的理化性質(zhì)，其氨基酸組成見表2。牦牛MSTN蛋白的原子組成是C1898H2994N506O561S21，分子質(zhì)量為42.55 ku，理論等電點(diǎn)pI約為6.14。氨基酸殘基中負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為40，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為45。亮氨酸(Leu)數(shù)目最多為37個(gè)，占整個(gè)氨基酸組成的9.9%，色氨酸(Trp)和組氨酸(His)數(shù)目最少為6個(gè)。天祝白牦牛MSTN蛋白的消光系數(shù)在280 nm時(shí)為5 980，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為40.48。

運(yùn)用Expasy服務(wù)器上的Protscale程序預(yù)測天祝白牦牛MSTN編碼蛋白的親水性/疏水性，圖3表明，第14位蛋氨酸(Met)疏水性最強(qiáng)(最高分值2.889)；第28位谷氨酸(Glu)親水性最強(qiáng)(最低分值-3.244)。按分值大小(Score<-2)劃分和總平均親水性值(-0.337)，天祝白牦牛MSTN蛋白有較強(qiáng)的親水區(qū)域，是可溶性蛋白。

圖2 天祝白牦牛MSTN基因的ORF分析Fig.2 ORF analysis and Pfam comparison of MSTN gene in Tianzhu white yak

表2 牦牛MSTN編碼蛋白的氨基酸組成

Table 2 The amino acid composition ofMSTNgene in Tianzhu white yak

氨基酸Aminoacid數(shù)量Number頻率Frequency/%Ala(A)184.8Cys(C)133.5Asp(D)154.0Glu(E)256.7Phe(F)143.7Gly(G)215.6His(H)61.6氨基酸Aminoacid數(shù)量Number頻率Frequency/%Ile(I)256.7Lys(K)277.2Leu(L)379.9Met(M)82.1Asn(N)154.0Pro(P)246.4Gln(Q)174.5氨基酸Aminoacid數(shù)量Number頻率Frequency/%Arg(R)184.8Ser(S)225.9Thr(T)236.1Val(V)215.6Trp(W)61.6Tyr(Y)123.2

2.5 天祝白牦牛mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)天祝白牦牛和甘南牦牛的c.417C>T位點(diǎn)進(jìn)行mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，SNP 位點(diǎn)突變致使兩個(gè)牦牛亞種mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異，并且導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能發(fā)生改變(圖4)。甘南牦牛mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能為-1 124.28 kJ·mol-1，天祝白牦牛為-1 135.16 kJ·mol-1。

2.6 天祝白牦牛MSTN編碼蛋白的二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

正值表示疏水，負(fù)值表示親水Positive value indicates hydrophobicity，negative value indicates hydrophilicity圖3 MSTN編碼蛋白的疏水性/親水性預(yù)測Fig.3 Hydrophobic/hydrophilic analysis for Tianzhu white yak MSTN

(A)天祝白牦牛 Tianzhu white yak； (B)甘南牦牛 Gannan yak圖4 牦牛RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of RNA in yak

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要指多肽鏈主鏈骨架依賴氫鍵排列成在一維方向上具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。本研究使用SOPMA軟件預(yù)測牦牛MSTN編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)，結(jié)果表明，165個(gè)氨基酸(總氨基酸的44.00%)和95個(gè)氨基酸(總氨基酸的25.33%)構(gòu)成無規(guī)則卷曲(random coil)和延伸鏈(extended strand)；另外87個(gè)氨基酸(總氨基酸的23.20%)和28個(gè)氨基酸(總氨基酸的7.47%)分別形成α-螺旋(α-helix)和β-轉(zhuǎn)角(β-turn)。按照Skolnick等[19]報(bào)道的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分型標(biāo)準(zhǔn)，天祝白牦牛MSTN編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)可歸為混合型。采用SWISS-MODEL對(duì)牦牛MSTN蛋白同源建模獲得三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖5)，該結(jié)果表明牦牛MSTN蛋白主要由無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

黑色代表α-螺旋；灰色代表無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角The black represents α-helix; the grey represents random coil and β-turn圖5 天祝白牦牛MSTN蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Putative tertiary structure of Tianzhu white yak MSTN

3 討論

大量研究顯示，MSTN基因是抑制肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子，MSTN基因的突變是導(dǎo)致安格斯、海福特、弗里生、夏洛來等牛出現(xiàn)“雙肌性狀”的決定性基因[20]。如果在牦牛群體中篩選出MSTN基因突變的個(gè)體，就可以選育出產(chǎn)肉率高的優(yōu)良種畜。因此對(duì)MSTN基因的深入研究能對(duì)天祝白牦牛的負(fù)調(diào)控肌細(xì)胞生長發(fā)育提供重要理論基礎(chǔ)。本研究對(duì)天祝白牦牛的MSTN基因3個(gè)克隆片段進(jìn)行拼接后得到了全長為1 128 bp 的編碼區(qū)序列，其中第1、2、3外顯子大小分別為 373、374、381 bp。天祝白牦牛和甘南牦牛MSTN基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)牦牛亞種間相差不大，僅在第2外顯子處存在1個(gè)c.417C>T位點(diǎn)的堿基突變，屬同義突變。這與杜曉華等[11]在西門塔爾牛上的研究結(jié)果完全一致。梁春年等[12]研究顯示，甘南牦牛與普通牛MSTN基因存在一個(gè)c.417C>T的沉默突變。基因突變屬于堿基對(duì)的改變，只涉及少數(shù)幾個(gè)密碼子的改變，并未改變密碼子的閱讀框；由于密碼子具有簡并性(即一個(gè)氨基酸可能對(duì)應(yīng)多個(gè)密碼子)，使得改變后的密碼子可能仍對(duì)應(yīng)原來的氨基酸，相應(yīng)的蛋白質(zhì)沒有發(fā)生改變[21]。既然兩個(gè)牦牛亞種和普通牛MSTN基因蛋白質(zhì)組成相同，那么該基因在兩個(gè)牦牛亞種間的基因表達(dá)調(diào)控方式也有可能相同，可以利用兩個(gè)牦牛亞種間任一物種在該基因研究方面取得的成果，運(yùn)用于另一物種的該基因的表達(dá)調(diào)控研究當(dāng)中，來加速其研究進(jìn)程[22]。

雖然MSTN基因在動(dòng)物進(jìn)化過程中高度保守，但也存在一定的多態(tài)性。Grobet等[23]在10個(gè)歐洲牛品種的32頭“雙肌?！比后w中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)SNPs，其中5個(gè)SNPs造成了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的改變，1個(gè)為保守氨基酸替換，1個(gè)為沉默DNA突變；在肉牛群體中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)SNPs，其中6個(gè)可導(dǎo)致雙肌性狀。冀德君等[24]在中國普通牛、大額牛、瘤牛和巴州牦牛4個(gè)群體中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)SNPs，巴州牦牛在2個(gè)位點(diǎn)上存在區(qū)別于瘤牛和普通牛的獨(dú)特堿基?？梢?，同一物種的不同品種間的堿基突變可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白質(zhì)功能，說明該基因具有作為遺傳標(biāo)記的潛在可能。

基因決定生物的性狀，但最終是由蛋白質(zhì)來體現(xiàn)的。目前大多學(xué)者對(duì)魚[4]、雞[5]、鹿[6]、馬[7]、貂[8]、羊[9]、豬[10]、普通牛[11]和甘南牦牛[12]等動(dòng)物的MSTN蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)功能預(yù)測。本研究預(yù)測結(jié)果表明，天祝白牦牛MSTN蛋白是由375個(gè)氨基酸折疊而成的不穩(wěn)定的親水蛋白。賈浩等[25]研究顯示，蛋白質(zhì)半衰期越長則穩(wěn)定性越高，而本研究發(fā)現(xiàn)，天祝白牦牛MSTN具有較長的半衰期(30 h)卻是不穩(wěn)定蛋白，這與賈浩等[25]的研究報(bào)道不符，MSTN出現(xiàn)這一特性可能與其不同生理功能的發(fā)揮存在某種聯(lián)系[26]。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析有助于了解氨基酸序列和三維構(gòu)象之間的聯(lián)系，更有助于認(rèn)識(shí)蛋白的空間結(jié)構(gòu)。本研究預(yù)測了天祝白牦牛MSTN蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型蛋白，主要以無規(guī)則卷曲(總氨基酸的44.00%)和延伸鏈(總氨基酸的25.33%)為主。無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體/受體結(jié)合的活性部位，易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象[27]。MSTN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中大量的無規(guī)卷曲可能影響蛋白質(zhì)肽鏈的結(jié)合活性，從而影響蛋白質(zhì)的功能。

mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，兩個(gè)牦牛亞種MSTN基因c.417C>T位點(diǎn)突變引起mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，并且導(dǎo)致其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能由甘南牦牛的-1 124.28 kJ·mol-1變?yōu)樘熳０钻笈５?1 135.16 kJ·mol-1。mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能的改變均會(huì)影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而可能會(huì)影響后續(xù)蛋白質(zhì)翻譯過程及其相關(guān)功能的表達(dá)。

本研究系統(tǒng)地對(duì)天祝白牦牛MSTN基因的理化性質(zhì)和蛋白的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了預(yù)測，在此基礎(chǔ)上我們將進(jìn)一步對(duì)MSTN基因的表達(dá)差異進(jìn)行探究，以期能更好地為天祝白牦牛的肉質(zhì)性狀的研究提供理論基礎(chǔ)，更好地將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Cloning and bioinformatics analysis ofMSTNgene of Tianzhu white yak

ZHANG Li， LIU Lixia， LI Qiangzi， CHEN Hong

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730030，China)

In order to elucidate the structure ofMSTNgene， the completeMSTNgene sequence of Tianzhu white yak was amplified and analyzed through PCR， cloning， sequencing and the bioinformatics tools. The results showed that the sequence ofMSTNgene was 1 128 bp in length and encoded 375 amino acids with a molecular weight of 42.55 ku and pI of 6.14. Bioinformatics prediction found that MSTN protein of Tianzhu white yak is unstable hydrophilic protein and mRNA secondary structure of minimum free energy is -1 135.16 kJ·mol-1. Protein secondary and tertiary structure were based on extended strand and random coil-based mixed-type protein. The results laid a foundation for further studying on the genetic characteristics and physiological mechanisms of MSTN.

Tianzhu white yak;MSTNgene; clone; bioinformatics

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.15

2016-09-26

西北民族大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目(xbmuyjrc201316)；西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院眾創(chuàng)空間扶持項(xiàng)目；西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(31920140077)

張麗(1980—)女，寧夏石嘴山人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail: zhangli2008@aliyun.com

S823.8+5

A

1004-1524(2017)04-0618-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 618-624

張麗，劉麗霞，李強(qiáng)子，等. 天祝白牦牛MSTN基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(4)： 618-624.