地衣芽孢桿菌BL-5芽孢生成條件優(yōu)化

陳文瑩，許云賀，諶小立，肖海蒂，王淋楓，黃濤，張莉力*

（1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義563000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001）

地衣芽孢桿菌BL-5芽孢生成條件優(yōu)化

陳文瑩1，2，許云賀2，諶小立1，肖海蒂2，王淋楓2，黃濤2，張莉力2*

（1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義563000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001）

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）作為微生態(tài)制劑在食品或飼料工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過(guò)溫度對(duì)地衣芽孢桿菌BL-5致死率的影響研究得出無(wú)芽孢菌體的致死溫度為75℃。以芽孢率和芽孢數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到地衣芽孢桿菌BL-5芽孢生成的最佳培養(yǎng)基配方為：蔗糖29.85 g/L、硫酸銨10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L、磷酸氫二鉀3.42 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、pH 8.0。最佳培養(yǎng)條件為：接種量5%、發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min。

地衣芽孢桿菌BL-5；芽孢率；芽孢數(shù)

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是芽孢桿菌屬的非致病性細(xì)菌，呈革蘭氏陽(yáng)性[1]、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性和氧化酶陽(yáng)性，形成內(nèi)生孢子[2]。在20世紀(jì)初，重組地衣芽孢桿菌生產(chǎn)的一些工業(yè)產(chǎn)品，在美國(guó)、歐洲和日本已被批準(zhǔn)生產(chǎn)。自1972年以來(lái)，地衣芽孢桿菌已被安全地用于大型工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)酶。隨后，地衣芽孢桿菌菌株在國(guó)際食品法典的第三版被列為食源性蛋白酶的來(lái)源和糖酶制劑[3]。

由于地衣芽孢桿菌生產(chǎn)淀粉酶，脂肪酶和蛋白酶的能力很強(qiáng)[4]，有利于營(yíng)養(yǎng)素的降解和吸收，增加飼料的利用率，也被廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)[5-6]。RANJIT K N等[2]在羅氏沼蝦幼體（4.0±0.02）g中研究了益生性地衣芽孢桿菌的膳食補(bǔ)充劑對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)和免疫響應(yīng)的影響，結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌的膳食補(bǔ)充可以調(diào)節(jié)羅氏沼蝦的腸道菌群、增加生長(zhǎng)和免疫應(yīng)答。地衣芽孢桿菌在較高濃度（1.0× 109CFU/g飼料）下益生效果更好。此外，地衣芽孢桿菌能夠增強(qiáng)動(dòng)物的抗氧化能力、免疫力及抗病力。ZHANGCN等[7]的研究表明，膳食低聚果糖（fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）和地衣芽孢桿菌能顯著提升三角魴（Megalobrama terminalis）的先天免疫和抗氧化能力，以及提高其抗病能力。這兩個(gè)益生元和/或益生菌的最佳組合是0.3%FOS和1×107CFU/g地衣芽孢桿菌。CHEN X M等[8]通過(guò)對(duì)鯉魚(yú)補(bǔ)充0、0.5%、1.0%和2.0%劑量的地衣芽孢桿菌XY-52進(jìn)行免疫刺激產(chǎn)生次級(jí)活性代謝產(chǎn)物，此產(chǎn)物對(duì)免疫響應(yīng)可以產(chǎn)生積極的影響，增強(qiáng)鯉魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染的抗病能力。周振峰[9]研究報(bào)道，地衣芽孢桿菌能有效地平衡和增強(qiáng)奶牛瘤胃有益微生物菌群的優(yōu)勢(shì)，能增強(qiáng)奶牛免疫力及抵抗疾病的能力，提高飼料的利用率。VINOJ G等[10]的結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌DAHB1可開(kāi)發(fā)用作預(yù)防性治療劑以抑制或減少在水產(chǎn)養(yǎng)殖中蝦的弧菌定植和死亡率。此外，地衣芽孢桿菌因能產(chǎn)生豐富的酶系，也長(zhǎng)期用于生產(chǎn)食品工業(yè)用的酶制劑[11]。REHMAN H U等[12]分離的地衣芽孢桿菌KIBGE IB-21具有果膠酶活性。

芽孢數(shù)和芽孢率作為芽孢桿菌性能的重要指標(biāo)，只有當(dāng)芽孢數(shù)和芽孢率較高時(shí)才能達(dá)到較好的益生效果。除了碳源和氮源對(duì)芽孢生成有影響外，趙曉燕等[13-14]報(bào)道磷酸氫二鉀和硫酸鎂對(duì)產(chǎn)孢菌株產(chǎn)孢能力有重要影響。因此本研究在前期實(shí)驗(yàn)對(duì)碳源和氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上[15]對(duì)影響地衣芽孢桿菌BL-5的芽孢數(shù)及芽孢率的因素（培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方中的無(wú)機(jī)鹽）進(jìn)行優(yōu)化，為后期進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持，為地衣芽孢桿菌BL-5作為微生態(tài)制劑在食品或飼料工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BL-5：錦州醫(yī)科大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸銨、NaCl、葡萄糖、蔗糖、MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、大豆蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 L，pH7.0。

促芽孢培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g、蛋白胨1.0 g、硫酸銨0.2 g、酵母膏0.7 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、磷酸氫二鉀1 g、瓊脂20 g（固體培養(yǎng)基時(shí)），水1 L，pH7.2。

優(yōu)化培養(yǎng)基：蔗糖29.85 g/L、硫酸銨10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L、硫酸鎂0.50 g/L、磷酸氫二鉀1.80 g/L、pH 8.0。

1.2 儀器與設(shè)備

M4-AL204電子分析天平：蘭州中西儀器有限公司；UV754PC紫外分光光度計(jì)：上海佑科儀表有限公司；SWCJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱：金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠；YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DK-98-1型水浴鍋：天津泰斯特儀器公司；DHP-9052型pH計(jì)：上海一恒科技有限公司；微量移液器：百得實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；HZQ-F200振蕩培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CX41生物顯微鏡：奧林巴斯（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化方法

將凍存于-80℃超低溫冰箱中的地衣芽孢桿菌BL-5以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接入5 mL種子培養(yǎng)基進(jìn)行活化，37℃搖床培養(yǎng)24 h，繼續(xù)傳代培養(yǎng)3代至菌種活力上升后，接種于斜面培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)瓊脂）上，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌種。

1.3.2 產(chǎn)芽孢菌的篩選

將活化后的保存于斜面上的菌株挑取少許劃線于促芽孢培養(yǎng)基平皿上，30℃培養(yǎng)24 h后挑選獨(dú)立且大菌落到裝有25 mL無(wú)菌生理鹽水中，振蕩均勻后置100℃水浴鍋中水浴10 min，再涂布于促芽孢培養(yǎng)基的平皿上培養(yǎng)，反復(fù)多次。最后選取平皿上的大菌落轉(zhuǎn)接到促芽孢培養(yǎng)基的試管斜面上，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)置于4℃冰箱冷藏室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 芽孢數(shù)及芽孢率的測(cè)定方法[16]

芽孢數(shù)（b）：將前期實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)速150 r/min條件下[6]搖床培養(yǎng)后的菌液，在致死溫度條件下處理15 min后，迅速用流水冷卻后采用稀釋梯度平皿計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)；

總菌數(shù)（a）：將培養(yǎng)后的菌液直接進(jìn)行稀釋梯度平皿計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)。

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]

（1）溫度對(duì)細(xì)菌致死率的影響

按5%的接種量，用優(yōu)化培養(yǎng)基在30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)地衣芽孢桿菌BL-5，然后進(jìn)行致死溫度實(shí)驗(yàn)，各取20 mL培養(yǎng)48 h的菌液分別在70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃溫度下水浴處理15 min后立即流水冷卻，以未經(jīng)處理的菌液為對(duì)照，測(cè)定細(xì)菌的致死率。

（2）各因素對(duì)芽孢數(shù)及芽胞率的影響

固定優(yōu)化培養(yǎng)基中的蔗糖29.85 g/L、硫酸銨10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L[15]、硫酸鎂0.50 g/L、pH 8.0，考察不同的發(fā)酵溫度（30℃、35℃、40℃）、接種量（3%、5%、8%、10%）、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度（1.14 g/L、2.28 g/L、3.42 g/L）、硫酸鎂質(zhì)量濃度（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L）發(fā)酵時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對(duì)芽孢數(shù)及芽孢率的影響。將每個(gè)時(shí)間段取的菌樣分為兩部分：一部分直接進(jìn)行稀釋，取三個(gè)稀釋度（10-5、10-6、10-7）進(jìn)行涂平板，以獲得菌樣總菌數(shù)；另一部分在致死溫度下水浴15min處理營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，以獲得芽孢數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)細(xì)菌的致死率的影響

因芽孢桿菌具有耐高溫特點(diǎn)，將溫度從70℃開(kāi)始設(shè)定，梯度設(shè)為每次增加5℃，最終增加至100℃，考察不同溫度條件下的致死率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同溫度對(duì)致死率的影響Fig.1 Effect of different temperature on lethality

由圖1可知，當(dāng)溫度為70℃時(shí)，致死率約為20%。當(dāng)升高至75～80℃時(shí)，致死率為60%左右；當(dāng)溫度為85℃時(shí)，致死率較80℃升高了近20%；當(dāng)溫度升至90～100℃時(shí)，各溫度之間的致死率差異并不顯著（P＞0.05），致死率近乎100%。

從溫度75℃和80℃的致死率變化情況可知，地衣芽孢桿菌BL-5在75～80℃這個(gè)溫度階段的致死率近似，并且75℃和80℃條件下的致死率并無(wú)顯著差別（P＞0.05），即在溫度為75℃時(shí)，不含芽孢的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞已被高溫致死，超過(guò)80℃后致死率又迅速上升，說(shuō)明主要死亡的為芽孢，因此75℃即為芽孢死亡開(kāi)始的臨界溫度，故確定無(wú)芽孢菌體的致死溫度為75℃，將此溫度作為芽孢數(shù)和芽孢率實(shí)驗(yàn)溫度選擇的依據(jù)。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢數(shù)及芽孢率的影響

考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on sporulation rate and spores number

由圖2中可知，發(fā)酵時(shí)間為36 h和48 h時(shí)的芽孢率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，芽孢率和芽孢數(shù)最高，與36 h的芽孢數(shù)存在顯著差異（P＜0.05）。綜合芽孢率和芽孢數(shù)，最終確定最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)芽孢數(shù)及芽孢率的影響

考察不同發(fā)醇溫度對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on sporulation rate and spores number

由圖3可知，3個(gè)溫度水平條件下的芽孢率存在顯著差異（P＜0.05），其中發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，芽孢率最佳。隨著發(fā)酵溫度升高，芽孢率顯著降低（P＜0.05）。發(fā)酵溫度對(duì)芽孢數(shù)的影響與對(duì)芽孢率的影響相似，都呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)芽孢數(shù)最佳，40℃時(shí)最差，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜合芽孢率和芽孢數(shù)，最終確定發(fā)酵溫度為30℃。2.4接種量對(duì)芽孢數(shù)及芽孢率的影響

考察不同接種量對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同接種量對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響Fig.4 Effect of different inoculum on sporulation rate and spores number

由圖4可知，接種量為3%與5%、8%、10%的芽孢率有著顯著差異（P＜0.05），而接種量為5%、8%、10%時(shí)，則沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。不同的接種量間芽孢數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。綜合芽孢率和芽孢數(shù)，當(dāng)接種量為5%時(shí)，芽孢率和芽孢數(shù)均最高。故最佳接種量為5%。

2.5 磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對(duì)芽孢數(shù)及芽孢率的影響

考察不同磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響Fig.5 Effect of different dipotassium phosphate concentration on sporulation rate and spores number

由圖5可知，在磷酸氫二鉀的三個(gè)質(zhì)量濃度中，3.42 g/L與1.14 g/L、2.28 g/L之間存在顯著差異（P＜0.05），當(dāng)磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為3.42 g/L時(shí)芽孢率和芽孢數(shù)均最高，其芽孢數(shù)達(dá)3.97×109CFU/mL。李忠等[18]在對(duì)枯草芽孢桿菌生防菌產(chǎn)孢條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中也使用了相似的磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度（3 g/L）。因此，綜合芽孢率和芽孢數(shù)，確定最佳磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為3.42 g/L。

2.6 硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)芽孢數(shù)及芽孢率的影響

考察不同硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)芽孢率和芽孢數(shù)的影響Fig.6 Effect of different magnesium sulfate concentration on sporulation rate and spores number

由圖6可知，當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)，芽孢率最佳；當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量濃度為1.0 g/L和1.5 g/L時(shí)，沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但芽孢率顯著高于0.5 g/L時(shí)（P＜0.05）。從芽孢數(shù)來(lái)看，硫酸鎂的3種質(zhì)量濃度之間存在顯著差異（P＜0.05），當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)芽孢數(shù)最佳，達(dá)2.23×109CFU/mL。王金玲等[19]在對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的優(yōu)化得到相似的硫酸鎂質(zhì)量濃度（1.2g/L）。因此，綜合芽孢率和芽孢數(shù)，最終確定最佳硫酸鎂質(zhì)量濃度為1.5g/L。

3 結(jié)論

通過(guò)溫度對(duì)地衣芽孢桿菌BL-5的影響研究得出無(wú)芽孢菌體的致死溫度為75℃，以此作為芽孢數(shù)和芽孢率實(shí)驗(yàn)溫度選擇的依據(jù)。以芽孢率和芽孢數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到地衣芽孢桿菌BL-5芽孢生成的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖29.85 g/L、硫酸銨10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L、磷酸氫二鉀3.42 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、pH 8.0。最佳培養(yǎng)條件為接種量5%、發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min。

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Optimization of sporulation conditions ofBacillus licheniformisBL-5

CHEN Wenying1,2,XU Yunhe2,SHEN Xiaoli1,XIAO Haidi2,WANG Linfeng2,HUANG Tao2,ZHANG Lili2*
(1.School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China;2.College of Food Science and Engineering, Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

Bacillus licheniformis,as micro-ecological agent,has broad application prospects in food and feed industry.The effect of temperature on B.licheniformisBL-5 lethality was studied.The results showed that lethal temperature of spore-free bacteria was 75℃.According to the sporulation rate and spores number,the optimal medium formula for the sporulation rate ofB.licheniformisBL-5 was as follows:sucrose 29.85 g/L,ammonium sulphate 10.00 g/L,yeast extract 3.00 g/L,dipotassium phosphate 3.42 g/L,magnesium sulfate 1.5 g/L,pH 8.0.The optimal culture conditions were as follows:inoculum 5%,fermentation time 48 h,fermentation temperature 30℃,and rotation speed 150 r/min.

Bacillus licheniformisBL-5;sporulation rate;spores number

S816

0254-5071（2017）04-0063-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.014

2016-11-11

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014022046）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301499）；遵義醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位授權(quán)支撐學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)

陳文瑩（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸铩?/p>

*通訊作者：張莉力（1977-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸铩?/p>