孔 菲， 蔡宇杰， 許 晨， 許建中， 夏金梅

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361005）

海洋細(xì)菌Planococcus rifietoensis發(fā)酵產(chǎn)色素培養(yǎng)基的優(yōu)化

孔 菲1，2，3， 蔡宇杰*2， 許 晨3， 許建中3， 夏金梅3

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361005）

在單因素的基礎(chǔ)上，以Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面（RSM）分析法，對(duì)產(chǎn)色素海洋細(xì)菌Planococcus rifietoensis發(fā)酵培養(yǎng)基的8個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分配比進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：培養(yǎng)基最佳碳氮源分別是葡萄糖和蛋白胨，葡萄糖、MgSO4·7H2O和酵母粉添加量顯著影響色素的產(chǎn)量。Box-Benhnken設(shè)計(jì)分析確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖9.78 g/L，蛋白胨 8.00 g/L，酵母粉2.05 g/L，MgSO4·7H2O 8.17 g/L，Na2HPO40.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，NaCl 10 g/L，CaCl20.1 g/L，培養(yǎng)54 h，在此培養(yǎng)條件下，色素的OD值可達(dá)0.984，比優(yōu)化前提高了245%。

海洋細(xì)菌；響應(yīng)面優(yōu)化；色素

色素是食品添加劑的重要組成成分，不僅廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)以全面改善食品的外觀和色澤[1]，還廣泛應(yīng)用于生物制藥、化妝品和紡織等領(lǐng)域[2]。天然色素由于產(chǎn)量低，著色力低，對(duì)光、熱、氧、酸堿穩(wěn)定性差，成本高等因素，在19世紀(jì)中葉逐步被合成色素取代[3-4]。隨著現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)合成色素具有不同程度的毒性，危害人體健康。而天然色素源于自然，在自然界中易被分解，不在生物體內(nèi)累積，無毒、安全性高，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理功能，因而越來越受到人們的青睞[5-6]。但是，動(dòng)植物來源的天然色素提取困難，難以大規(guī)模生產(chǎn)，與動(dòng)、植物色素相比，微生物色素不易受氣候、地域等因素影響，是一類優(yōu)良的天然色素來源[7-8]。微生物生產(chǎn)的色素種類繁多，有類胡蘿卜素、黑色素、醌類等[9]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)各種微生物色素進(jìn)行了研究，Vimal S等用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了紅曲霉MTCC410液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的培養(yǎng)條件[10]，Wang等采用Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計(jì)研究培養(yǎng)條件對(duì)Duganella SP發(fā)酵生產(chǎn)紫色桿菌素的影響[11]，Claira等分離Serratia marcescens并以紅糖作為其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)靈菌紅素[12]。海洋微生物產(chǎn)色素也得到了關(guān)注，何磊研究了培養(yǎng)基組分和發(fā)酵工藝條件對(duì)一株海洋酵母菌產(chǎn)蝦青素的影響并探索了胞內(nèi)色素的保藏穩(wěn)定性[13]，王曉磊對(duì)1株由威海近海分離得到的海洋細(xì)菌SS04進(jìn)行了鑒定并探究了其發(fā)酵條件的優(yōu)化[14]。

海洋微生物主要包括生活在海水、海洋沉積物中的微生物（海泥）及與海洋動(dòng)植物共附生的微生物[15]。由于其所處的高壓、高鹽、低溫、缺氧、低營(yíng)養(yǎng)等獨(dú)特的環(huán)境，海洋微生物能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎并具有良好生物活性的天然產(chǎn)物。目前海洋微生物資源的研究和開發(fā)越來越受到世界各國(guó)的重視[16]。海洋色素正處在一個(gè)快速發(fā)展的階段，很多的色素分子已經(jīng)被證明具有生物活性，從抗微生物到抗腫

瘤等[17-18]。

本文作者以一株能產(chǎn)黃色素的海洋細(xì)菌為研究對(duì)象，首先在單因素的基礎(chǔ)上用PB試驗(yàn)篩選出對(duì)色素產(chǎn)量有顯著影響的因素，再進(jìn)行響應(yīng)面的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 萊比托泉?jiǎng)有郧蚓?Planococcus rifietoensis（菌株編號(hào)1A05980），國(guó)家海洋局第三海洋研究所菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）平板培養(yǎng)基：2216E海洋細(xì)菌培養(yǎng)基。

2）種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，MgSO4· 7H2O 2 g，陳海水1 000 mL；pH為6。

3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

4）培養(yǎng)基滅菌條件為：121℃下滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計(jì)，北京普希通用儀器有限公司制造；DYML-S50A-3型壓力蒸汽滅菌鍋，北京勤誠(chéng)盛達(dá)科學(xué)儀器有限公司制造；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司制造；LRH-70F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司制造；GZX-9420 MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；J-25型低溫高速離心機(jī)，貝克曼有限公司制造；KQ-700DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 挑取一環(huán)活化于2216E平板固體培養(yǎng)基上的1A05980單菌落，接種至裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶，在180 r/min、25℃條件下培養(yǎng)12 h。以體積分?jǐn)?shù)6%的接種量移取種子液至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，在180 r/min、25℃條件下振蕩培養(yǎng)54 h，獲得已產(chǎn)色素的發(fā)酵液。

1.2.2 色素的提取 將發(fā)酵液在118.54 g的條件下離心15 min，棄上清液，得金黃色菌體，烘干至質(zhì)量恒定，研碎，添加一定體積的溶劑，作超聲波提取15 min，浸泡2 h后，離心得黃色素浸提液，濃縮得黃色素粗提物[19]。菌體干重法測(cè)定生物量。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 取色素的甲醇浸提液，利用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，空白對(duì)照為甲醇，選取掃描波長(zhǎng)為200～800 nm，確定其最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 通過單因素試驗(yàn)篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基適宜的氮源、碳源。再進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[20]。本實(shí)驗(yàn)中采用N=12的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的8個(gè)成分質(zhì)量濃度（A為葡萄糖；B為蛋白胨；C為酵母粉；D為 MgSO4· 7H2O；E為FeSO4·7H2O；F為 Na2HPO4；G為CaCl2；H為NaCl）進(jìn)行考察，響應(yīng)值為色素OD值（Y）。每個(gè)因素取高水平“1”和低水平“-1”，并設(shè)3個(gè)虛擬變量作誤差分析，用Design expert 8.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

表1 PB設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of the Plackett-Burman design

在Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)確定影響黃色素產(chǎn)量的3個(gè)主要因素進(jìn)行Box-Benhnken設(shè)計(jì)[20]。每個(gè)因素取3個(gè)水平（見表2），對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行回歸分析得到一個(gè)二次多項(xiàng)式方程，此方程反映了響應(yīng)量與自變量的關(guān)系，進(jìn)而分析確定細(xì)菌1A05980發(fā)酵產(chǎn)色素的最佳培養(yǎng)基。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平Table 2 Factors and levels of the response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

將等量的菌體分別浸泡于多種試劑2 h后，觀察發(fā)現(xiàn)，該黃色素在極性不同的溶劑中的溶解度存在明顯的差異，如表3所示。石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷等極性較小的溶劑浸泡菌體后，所得溶液幾乎不呈現(xiàn)黃色，即該黃色素在其中的溶解度極?。欢状冀菥w所得溶液黃色明顯較深，乙醇和乙酸次之。因此選擇甲醇作為色素的提取溶劑。

表3 色素提取溶劑的選擇Table 3 Choice of extraction solvents

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

全波長(zhǎng)掃描后分析圖譜（圖1）可知其最大吸收波長(zhǎng)為480 nm。

圖1 色素溶液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of the pigment solution

2.3 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

按1.2.1培養(yǎng)細(xì)菌1A05980，分別取培養(yǎng)時(shí)間為6、12、18、24、30、36、48、54 h和72 h的發(fā)酵液20 mL提取色素，測(cè)定色素OD值，其結(jié)果如圖2所示，在發(fā)酵過程中，1A05980菌株在6～72 h范圍內(nèi)均有黃色素產(chǎn)生，且培養(yǎng)至54 h時(shí)，黃色素產(chǎn)量最高，由此得出該菌株最適發(fā)酵時(shí)間為54 h。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 不同碳源對(duì)色素產(chǎn)量的影響 按照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度0.5 g/dL的葡糖糖、蔗糖、乳糖、甘油、麥芽糖、麥芽糊精、可溶性淀粉作為碳源，接種量體積分?jǐn)?shù)6%、25℃、180 r/min培養(yǎng)54 h，測(cè)色素OD值和生物量。如圖3所示，以葡萄糖作為碳源時(shí)，海洋細(xì)菌1A05980產(chǎn)色素OD值最高，以麥芽糖作為碳源時(shí)，生物量雖然較高，但是色素產(chǎn)量較少，加之工業(yè)葡萄糖價(jià)格便宜，使用起來成本較低，因此選擇葡萄糖作為發(fā)酵生產(chǎn)的碳源。

圖2 菌株1A05980的產(chǎn)色素曲線Fig.2 Time dependence of pigment production by strain 1A05980

圖3 碳源種類對(duì)海洋細(xì)菌1A05980產(chǎn)色素的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on pigment production of marine bacterium 1A05980

2.4.2 不同氮源對(duì)色素產(chǎn)量的影響 以質(zhì)量濃度為1 g/dL的葡萄糖作為碳源，分別添加質(zhì)量濃度0.5 g/dL的酵母粉和蛋白胨，接種體積分?jǐn)?shù)6%、180 r/min、25℃培養(yǎng)54 h，測(cè)定色素OD值和生物量。如圖4所示，單獨(dú)以酵母粉或蛋白胨為氮源時(shí)，色素的產(chǎn)量都不高，再考察添加質(zhì)量濃度0.1 g/dL的酵母粉分別與質(zhì)量濃度0.5 g/dL的蛋白胨、酵母膏、干酪素、硝酸鉀、脲和硫酸銨混合作為氮源。研究發(fā)現(xiàn)，以酵母粉和蛋白胨混合作為氮源時(shí)，色素的OD值較高。因此選擇酵母粉和蛋白胨混合作為細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)色素的氮源。結(jié)果總體顯示，添加有機(jī)氮源比無機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)色素更有利，這可能是有機(jī)氮源除了為菌體的生長(zhǎng)提供氮源外，還能提供必要的生長(zhǎng)因子，有利于色素的產(chǎn)生。

2.4.3 NaCl添加量對(duì)產(chǎn)色素的影響 由于菌株1A05980為海洋細(xì)菌，仍具備海洋微生物一些不同于陸地微生物的生活習(xí)性和遺傳特征。NaCl通常在培養(yǎng)基中起著維持菌體內(nèi)外滲透壓、維持細(xì)胞內(nèi)外電勢(shì)差、參與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖饔肹21]。在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0～40 g/L的NaCl，考察菌株產(chǎn)色素和生長(zhǎng)的變化，結(jié)果顯示（圖5），當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度處于10～20 g/L范圍內(nèi)，均有利于菌體的生長(zhǎng)?？紤]到過高的鹽度造成反應(yīng)設(shè)備的腐蝕并在下游工程中造成不便 ，選擇10 g/L的NaCl添加量。

圖4 氮源種類對(duì)海洋細(xì)菌1A05980產(chǎn)色素的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on pigment production of marine bacterium 1A05980

圖5 不同鹽度對(duì)海洋細(xì)菌1A05980產(chǎn)色素的影響Fig.5 Effect of salinity on pigment production of marine bacterium 1A05980

2.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選顯著因素

通過Plackett-Burman試驗(yàn)，篩選出對(duì)海洋細(xì)菌1A05980液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素有顯著影響的營(yíng)養(yǎng)成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，PB設(shè)計(jì)方差分析見表5。從各變量的回歸系數(shù)可看出葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaCl顯 示 正 效 應(yīng) ，Na2HPO4顯示負(fù)效應(yīng)。PB設(shè)計(jì)結(jié)果的方差分析表明，葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O的效應(yīng)最大，且在置信區(qū)間 95%之中，是影響色素產(chǎn)量的顯著因素。所以將葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度進(jìn)一步采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分。

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 4 Experimental design and results of the PBD

表5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)方差分析Table 5 Results of the PBD ANOVA analysis

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

以葡萄糖（α）、酵母粉（β）、MgSO4·7H2O（γ）3個(gè)因素為自變量，色素的OD值（Y）為響應(yīng)值，以Box-Benhnken模型進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用 Design Expert 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。擬合得到二次回歸模型如下：

此數(shù)學(xué)模型的方差分析結(jié)果見表7，模型的P< 0.000 1，表明該模型顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)的P=0.941 2，表明模型擬合程度理想；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.987 9（R2Adj=0.972 2），表明方程的擬合度較好。由回歸模型繪出葡萄糖、酵母粉和MgSO4· 7H2O對(duì)色素吸光度值影響的曲面圖和等高線圖（圖6）?；貧w方程求導(dǎo)得到此模型的最大值，當(dāng)葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O的添加量分別為9.78、2.05 g/L和8.17 g/L，最大響應(yīng)值為1.039 35。因此確定海洋細(xì)菌1A05980發(fā)酵產(chǎn)色素的最優(yōu)培養(yǎng)基組分：葡萄糖9.78 g/L，蛋白胨 8.00 g/L，酵母粉2.05 g/L，MgSO4·7H2O 8.17 g/L，Na2HPO40.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，NaCl 10 g/L，CaCl20.1 g/L。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，使用此培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時(shí)間54 h，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)際的色素吸光度平均值為0.984。實(shí)際值達(dá)到理論預(yù)測(cè)值的94.67%，十分接近，說明該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

表6 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table6 Experimentaldesign and resultsofBox-Benhnken design（BBD）

表7 RSM設(shè)計(jì)的多元二次模型方差分析Table 7 ANONA for the response surface quadratic model

圖6 葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O對(duì)色素吸光度影響的曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of cross-interaction among glucose，yeast extract and MgSO4·7H2O on the production of pigment

3 結(jié)語(yǔ)

運(yùn)用Plackett-Burman法確定了葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O是影響海洋細(xì)菌1A05980液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素的主要因素，然后采用響應(yīng)面法中的Box-Benhnken設(shè)計(jì)建立了顯著因子與色素產(chǎn)量的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，確定液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：葡萄糖9.78 g/L，蛋白胨8.00 g/L，酵母粉2.05 g/L，MgSO4·7H2O 8.17 g/L，Na2HPO40.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，NaCl 10 g/L，CaCl20.1 g/L。使用此培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時(shí)間54 h，得到發(fā)酵液色素的OD值為0.984，較初始量0.285提高了3.45倍。同時(shí)，模型所得到的最大預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值非常接近，說明回歸方程能較真實(shí)地反映各篩選因素的影響。在產(chǎn)量?jī)?yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)色素的色譜分析，純化鑒定及色素的性質(zhì)將在進(jìn)一步的研究和后續(xù)文章中討論。

實(shí)驗(yàn)證明，Plackett Burman設(shè)計(jì)與 Box-Benhnken Design設(shè)計(jì)相結(jié)合的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法能快速、有效地從眾多影響色素液體發(fā)酵的因素中篩選出比較重要的影響因素并實(shí)現(xiàn)優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基成分，優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際發(fā)酵情況吻合較好。

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Optimization of Fermentation Medium for the Production of Pigments by Marine Bacteria Planococcus rifietoensis

KONG Fei1，2，3， CAI Yujie*2， XU Chen3， XU Jianzhong3， XIA Jinmei3
（1.SchoolofBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Key Laboratory ofIndustrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China）

Based on monofactorial experiments，Plackett-Burman（PB）design and response surface methodology（RSM）were applied to optimize 8 medium components for the production of pigments by marine bacteria strain Planococcus rifietoensis.Results showed that optimal carbon and nitrogen sources of the medium were glucose and peptone，respectively，and glucose，yeast extract and MgSO4·7H2O had major effects on the production of pigments.The optimal culture medium was comprised of glucose 9.78 g/L，peptone 8.00 g/L，yeast extract 2.05 g/L，MgSO4·7H2O 8.17 g/L，Na2HPO40.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，NaCl 10 g/L and CaCl20.1 g/L.The incubation time was 54 hours.Under these conditions，the optical density（OD）of pigments reached to 0.984，which was245%higher than that before optimization.

marine bacteria，response surface optimization，pigment

Q 815

A

1673—1689（2017）02—0179—08

2015-04-08

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（海三科2015027）。

*通信作者：蔡宇杰（1973—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生物工程方面的研究。

E-mail：yjcai@jiangnan.edu.cn

孔菲，蔡宇杰，許晨，等.海洋細(xì)菌Planococcus rifietoensis發(fā)酵產(chǎn)色素培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（02）：179-186.