王云云++孫全喜+王秀貞++唐月異++吳琪 張青云 曹廣英 祁雪 張君 王傳堂

摘要：脫落酸（ABA）在植物生長發(fā)育中起著重要的作用，9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（NCED）是其合成途徑中的關(guān)鍵基因。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)在花生種子中克隆到其同源基因[WTBX][STBX]AhNCED1，預(yù)測(cè)該基因開放閱讀框?yàn)? 806 bp，編碼601個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為66.8 ku，等電點(diǎn)為8.49。通過生物信息學(xué)分析表明，該基因含有2種跨膜區(qū)，但均不明顯；由17個(gè)絲氨酸、8個(gè)蘇氨酸、5個(gè)酪氨酸參與磷酸化過程；同源比較發(fā)現(xiàn)，該基因與來自擬南芥、柱花草等的NCED具有較高的同源性，進(jìn)化分析表明該基因與柱花草NCED的親緣關(guān)系最近。筆者成功構(gòu)建了該基因的亞細(xì)胞定位載體[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP和超表達(dá)載體pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1，為進(jìn)一步研究花生中[WTBX][STBX]AhNCED1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；[WTBX][STBX]AhNCED1基因；生物信息學(xué)；載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：Q782；S565.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0020-04

收稿日期：2015-12-22

基金項(xiàng)目：國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：CARS-14）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金（編號(hào)：2016YQN17、2015YQN13）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育計(jì)劃（編號(hào)：2014CGPY09）。

作者簡介：王云云（1989—），女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士研究生，主要從事花生生物技術(shù)等研究，E-mail：13001661900@163.com；共同第一作者：孫全喜（1983—），男，山東章丘人，博士，副研究員，主要從事花生遺傳改良等研究，E-mail：sunqx1983@163.com。

通信作者：王傳堂，博士，研究員，主要從事花生分子育種等研究，E-mail：chinapeanut@126.com；張君，博士，教授，主要從事花生生物技術(shù)等研究，E-mail：zhangjun@jlau.edu.cn。

花生栽培種（Arachis hypogaea L.），別稱落花生，是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，在油料生產(chǎn)和國際貿(mào)易中占有舉足輕重的地位。與油菜、芝麻、向日葵等油料作物相比，花生的單產(chǎn)、總產(chǎn)量和出口量均居首位[1]。

脫落酸（ABA）是以異戊二烯為基本單位的一種十五碳類倍半萜類植物激素，因能促進(jìn)葉片脫落而得名[2]。ABA在植物生長發(fā)育中起著重要的作用，如促進(jìn)器官脫落、促進(jìn)種子成熟和休眠、抑制種子萌發(fā)等。9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，簡稱NCED）是ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。第1個(gè)NCED基因在玉米ABA缺失突變體vpl4中被克隆[3]，隨后研究人員在其他植物，如番茄[4]、菜豆[5]、擬南芥[6]、柱花草[7]中克隆了NCED基因。豆類作物中pvNCED基因的表達(dá)能延緩種子的萌發(fā)[8]。馬鈴薯（Solanum tuberosum）中l(wèi)eNCED基因的過量表達(dá)能提高ABA的含量，同時(shí)增強(qiáng)種子休眠性[9]。陳靜等通過熒光定量PCR分析表明，在休眠和無休眠種子吸漲萌發(fā)過程中，[WTBX][STBX]AhNCED2對(duì)于維持種子休眠發(fā)揮了積極作用[10]。

本研究在花生X-166種子中克隆到ABA合成途徑中關(guān)鍵基因[WTBX][STBX]AhNCED1，用系統(tǒng)發(fā)育樹分析與柱花草的親緣關(guān)系。通過多種生物在線工具分析該基因的跨膜區(qū)。筆者擬構(gòu)建該基因的亞細(xì)胞定位載體[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP和超表達(dá)載體pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1，為研究該基因的細(xì)胞定位情況和在花生種子休眠中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料、質(zhì)粒及載體

本試驗(yàn)所用植物材料花生X-166[11]由山東省花生研究所提供；pCambia1390-eGFP，由山東省水稻研究所謝先芝研究員饋贈(zèng)；植物表達(dá)載體pCambia2300EC（添加了35S啟動(dòng)子及Tnos終止子的pCambia2300載體），由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)亓寶秀教授饋贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1[WTBX][STBX]AhNCED1基因序列的獲得及PCR擴(kuò)增利用花生[WTBX][STBX]NCED1 mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：AJ574819.2），根據(jù)預(yù)測(cè)基因的開放閱讀框（ORF），用DNAClub設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)SacⅠ的引物F1、R1（表1）?；ㄉN子RNA的提取，用ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈cDNA，利用PCR對(duì)該基因的開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增。其中PCR反應(yīng)體系：10 μL 5×HF Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs Mix，2 μL引物F1，2 μL引物R1，0.6 μL二甲基亞砜（DMSO），0.2 μL高保真酶Phusion（New England Labs），1 μL模板，32.2 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，30次循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，切取含目的條帶的凝膠，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt simple載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）連接、熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（北京全式金生物技術(shù)有限公司），將陽性克隆送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因的生物信息學(xué)分析利用DNAMAN序列分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)；利用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html）進(jìn)行跨膜分析；利用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)。

1.2.3用于亞細(xì)胞定位載體的改造以含綠色熒光蛋白（GFP）的質(zhì)粒pCambia1390-eGFP稀釋物為模板，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物F2、R2（表1），將得到的片段連接到克隆載體pEASY-blunt simple上，得到質(zhì)粒pEASY-GFP。參照質(zhì)粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明步驟，提取pEASY-GFP、pCambia2300EC質(zhì)粒。通過限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SacⅠ分別對(duì)pEASY-GFP和植物表達(dá)載體pCambia2300EC進(jìn)行酶切，回收目的片段、載體片段，用連接酶Solution Ⅰ[寶生物工程（大連）有限公司]于16 ℃過夜連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取單菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定，獲得帶有GFP基因的載體pCambia2300EC-GFP。

1.2.4花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建參照質(zhì)粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明步驟，提取pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1、pCambia2300EC-GFP質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ對(duì)兩者進(jìn)行單酶切，對(duì)pCambia2300EC-GFP酶切時(shí)進(jìn)行去磷酸化處理，回收目的片段、載體片段，使用連接酶Solution Ⅰ[寶生物工程（大連）有限公司]進(jìn)行16 ℃過夜連接，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取單菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定，獲得帶有[WTBX][STBX]AhNCED1基因的亞細(xì)胞定位載體[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP。

1.2.5花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因超表達(dá)載體構(gòu)建參照質(zhì)粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明步驟，提取pCambia2300EC質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ對(duì)植物表達(dá)載體pCambia2300EC進(jìn)行酶切，同時(shí)進(jìn)行去磷酸化處理，回收載體片段，使用連接酶Solution Ⅰ[寶生物工程（大連）有限公司]將“1.2.4”節(jié)中回收的目的片段與該載體片段于16 ℃進(jìn)行過夜連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取單菌落進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，獲得帶有[WTBX][STBX]AhNCED1的植物表達(dá)載體pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1。

2結(jié)果與分析

2.1花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因的克隆

以O(shè)RF兩側(cè)設(shè)計(jì)的引物F1、R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到約為1 800 bp的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件分析得到長度為 1 806 bp 的ORF，編碼601個(gè)氨基酸。將該基因推導(dǎo)的氨基酸序列與[WTBX][STBX]AhNCED1（登錄號(hào)：CAE00459.2）進(jìn)行比對(duì)分析，兩者的同源相似性為99%，證實(shí)該序列為花生NCED基因片段，名稱為[WTBX][STBX]AhNCED1。將該基因的氨基酸序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行在線BLASTp分析，表明該氨基酸序列與其他植物的NCED氨基酸有較高的相似性，它與柱花草（Stylosanthes guianensis，AAY98512.2）的相似性為93%，與檸條錦雞兒（Caragana korshinskii，ACU86971.1）的相似性為78%，與鷹嘴豆（Cicer arietinum，BAM72560.1）的相似性為74%，與豌豆（Pisum sativum，BAC10550.1）的相似性為74%，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_193569.1）的相似性為63%。利用DNAMAN軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果見圖2。

2.2蛋白質(zhì)性質(zhì)預(yù)測(cè)

采用ExPASy ProtParam預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)性質(zhì)，結(jié)果顯示，AhNCED1蛋白的理論分子質(zhì)量為66.8 ku，理論等電點(diǎn)為 8.49，分子式為C2985H4665N813O880S25，原子數(shù)為9 368個(gè)，帶負(fù)電荷氨基酸（Asp+Glu）數(shù)69個(gè)，帶正電荷氨基酸（Arg+Lys）數(shù)74個(gè)，脂溶系數(shù)為75.12，總平均親水性（GRAVY）為-0.389。用TMpred工具預(yù)測(cè)蛋白的跨膜區(qū)和跨膜方向，結(jié)果表明，228至261位氨基酸處可能有1個(gè)由內(nèi)向外的跨膜區(qū)，在225至256位氨基酸處可能有1個(gè)由外向內(nèi)的跨膜區(qū)，這2種跨膜區(qū)均不明顯（圖3）。

2.3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用NetPhos 2.0 Server在線工具預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明有17個(gè)絲氨酸（serine，簡稱S）、8個(gè)蘇氨酸（threonine，簡稱T）、5個(gè)酪氨酸（tyrosine，簡稱Y）參與磷酸化過程（圖4）。用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5），結(jié)果顯示，AhNCEDI蛋白的Qmean 4為-4.06。

2.4[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP載體構(gòu)建

[CM（24]以含GFP的質(zhì)粒稀釋物為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得約[CM）]

[TPWYY4.tif][FK）]

[FK（W12][TPWYY5.tif][FK）]

760 bp的片段。將帶有GFP的克隆載體pEASY-GFP與植物表達(dá)載體pCambia2300EC同時(shí)用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SacⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段和載體，并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化、菌落PCR鑒定（圖6）。挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明，pCambia2300EC-GFP載體構(gòu)建成功。將帶[JP3]有[WTBX][STBX]AhNCED1的克隆載體pEASY-[JP][WTBX][STBX]AhNCED1、pCambia2300EC-GFP載體同時(shí)用SacI進(jìn)行單酶切，結(jié)果見圖7?；厥蛰d體片段與目的片段，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆測(cè)序，序列分析表明[WTBX][STBX]AhNCED1基因已插入到pCambia2300EC-GFP載體中，表明[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP載體構(gòu)建成功。

[FK（W10][TPWYY6.tif][FK）]

2.5花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因超表達(dá)載體構(gòu)建

將帶有[WTBX][STBX]AhNCED1的克隆載體pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1、植物表達(dá)載體pCambia2300EC同時(shí)利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ進(jìn)行單酶切，植物表達(dá)載體pCambia2300EC酶切結(jié)果見圖8，pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1酶切結(jié)果見圖7-A?；厥漳康钠魏洼d體片段，利用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，[WTBX][STBX]AhNCED1片段已準(zhǔn)確插入到植物表達(dá)載體pCambia2300EC上。

[FK（W25][TPWYY7.tif][FK）]

[FK（W12][TPWYY8.tif][FK）]

3討論與結(jié)論

種子缺乏休眠性既可能與種子內(nèi)源ABA含量低有關(guān)，也可能是種子本身對(duì)ABA的敏感性降低所致[12]。ABA生物合成基因的過量表達(dá)可以增加種子中ABA的含量，從而促進(jìn)種子休眠或延遲萌發(fā)[13]。NCED是ABA合成途徑中關(guān)鍵酶。擬南芥中有5個(gè)NCED基因，只有[WTBX][STBX]AtNCED6、AtNCED9這2個(gè)基因都發(fā)生突變的擬南芥種子才能萌發(fā)，若只有1個(gè)基因突變，種子仍然處于休眠狀態(tài)[14]。乙烯利作用下花生種子休眠解除過程中，ABA合成關(guān)鍵基因[WTBX][STBX]AhNCED2表達(dá)量下調(diào)[10]，這表明[WTBX][STBX]AhNCED2在種子休眠中起著重要作用。研究蛋白在細(xì)胞中的定位方法主要有融合報(bào)告基因定位法、免疫組織化學(xué)定位法、蛋白質(zhì)組學(xué)定位技術(shù)以及共分離標(biāo)記酶輔助定位法，其中融合報(bào)告基因定位法應(yīng)用廣泛[15]。本研究在花生中克隆到1個(gè)NCED基因，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，認(rèn)為是花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因。筆者對(duì)其序列進(jìn)行了分析，并成功構(gòu)建了該基因的亞細(xì)胞定位載體和超表達(dá)載體，為深入了解該基因在花生中的功能提供了可能。

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