林嬋春++何冬梅++李佳穗++柳敏++嚴(yán)鑄云

摘要：為了了解川芎內(nèi)生放線菌抑制常見致病菌的能力，從中篩選活性較強(qiáng)的放線菌資源，采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定發(fā)酵提取液對(duì)5種指示菌的抑菌活性，結(jié)合經(jīng)典分類法和分子生物學(xué)法鑒定活性菌種。結(jié)果表明，對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）和白色念球菌（Canidia albicans）表現(xiàn)抑制活性的菌株占川芎內(nèi)生放線菌的百分比分別為83.33%、76.67%、23.33%、3000%、13.33%；從中選出4株活性較強(qiáng)的放線菌，Blast比對(duì)結(jié)果表明，菌株F3、F19、F-L-5、F-L-7的16S rDNA序列與GenBank已知序列鏈霉菌屬金色類群[Streptomyces sp.（KF126314.1）]、暗灰鏈霉菌[Streptomyces canus（AB7184118.1）]、腫痂鏈霉菌[Streptomyces turgidiscabies（FJ883749.1）]、暗色產(chǎn)色鏈霉菌[Streptomyces phaeochromogenes（KP718589.1）]高度相似，同源性分別為99%、100%、99%、99%。綜合鑒定，F(xiàn)3為鏈霉菌屬金色類群，F(xiàn)19為暗灰鏈霉菌，F(xiàn)-L-5為腫痂鏈霉菌，F(xiàn)-L-7為暗色產(chǎn)色鏈霉菌。表明川芎內(nèi)生放線菌中具有應(yīng)用潛力的高活性菌株，并鑒定出4株活性菌。

關(guān)鍵詞：川芎；內(nèi)生放線菌；抑菌活性；菌種鑒定；鏈霉菌

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0076-04

收稿日期：2016-07-17[HJ1.4mm]

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81001610）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號(hào)：20135132110004）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（編號(hào)：ZRQN1546）。

作者簡(jiǎn)介：林嬋春（1989—），女，碩士研究生，主要從事藥用植物微生態(tài)研究。E-mail：1297107706@qq.com。

通信作者：嚴(yán)鑄云，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事道地藥材品質(zhì)形成與調(diào)控研究。Tel：（028）61800231；E-mail：cdutcmyan@126.com。[HJ]

放線菌是尋找和發(fā)現(xiàn)天然活性物質(zhì)的生物資源之一，也是人們不懈研究的熱點(diǎn)[1]。目前，發(fā)現(xiàn)新放線菌及新活性物質(zhì)變得越來(lái)越困難，人們開始從特殊生境中尋找有用的放線菌[2]。植物內(nèi)生放線菌生長(zhǎng)環(huán)境獨(dú)特，常產(chǎn)生多種類型的代謝產(chǎn)物[3]。筆者所在課題組前期篩選出了對(duì)川芎根腐病病原菌有拮抗活性的川芎內(nèi)生放線菌[4]。本研究選取代表性細(xì)菌及真菌作為指示菌，篩選具有抑菌作用的放線菌資源，為開發(fā)利用植物內(nèi)生放線菌提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種川芎內(nèi)生放線菌由課題組從健康川芎根莖中進(jìn)一步分離并保存。

1.1.2指示菌[5-6]革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）；革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；酵母狀真菌：白色念球菌（Canidia albicans）；絲狀真菌：黑曲霉（Aspergillus niger）。以上菌株均由成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院贈(zèng)予。

1.1.3培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基采用高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基。形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化測(cè)定所用培養(yǎng)基的成分和制備方法均參考《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[6]和《放線菌系統(tǒng)學(xué)》[7]。活化培養(yǎng)細(xì)菌、黑曲霉及白色念球菌的培養(yǎng)基分別采用肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基，成分和制備方法參照文獻(xiàn)[8-9]。

1.2方法

1.2.1[JP2]發(fā)酵粗提液的制備將供試菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)5 d，接種1枚直徑5 mm的菌餅于250 mL發(fā)酵瓶中，每瓶發(fā)酵液50 mL。28 ℃、2 000 r/min搖瓶培養(yǎng)，6 d后取出發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取2次，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得漿狀物2～3 mL，35 ℃下?lián)]發(fā)干，最后用無(wú)水乙醇定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，保存?zhèn)溆肹10]。[JP]

1.2.2抑菌活性測(cè)定采用紙片法[10]測(cè)定內(nèi)生放線菌發(fā)酵液的抑菌活性，即將60 μL發(fā)酵粗提液分次加到9 mm無(wú)菌濾紙片上，待乙醇揮發(fā)干后接于含指示菌的平板上。細(xì)菌用5 mg/mL 的雙抗溶液10 μL為對(duì)照（CK1），真菌用5 mg/mL氟康唑溶液20 μL為對(duì)照（CK2），設(shè)3組重復(fù)，24～48 h后測(cè)量抑菌圈的直徑，以平均抑菌圈直徑大小作為抑菌活性強(qiáng)弱的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3形態(tài)及生理生化特征菌株的形態(tài)特征采用插片法在光學(xué)顯微鏡下觀察。培養(yǎng)特征及生理生化特性采用常規(guī)放線菌鑒定方法，并參照文獻(xiàn)[11]及《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[6]中推薦的培養(yǎng)基。

1.2.4分子水平鑒定采用高氏1號(hào)液體富集培養(yǎng)方式，獲取菌絲，用液氮充分研磨破壁后，結(jié)合試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit（TIANGEN）提取基因組DNA[12]。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA提取效果。采用放線菌通用引物27F和1 492R對(duì)放線菌的16S rDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix[天根生化科技（北京）有限公司]12 μL，ddH2O[天根生化科技（北京）有限公司]10 μL，參照文獻(xiàn)[12]中的程序擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)定的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載同源性極高的序列，采用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1川芎內(nèi)生放線菌的活性菌株

通過(guò)紙片法考察了30株川芎內(nèi)生放線菌的抑菌活性（表1）。結(jié)果表明，不同內(nèi)生放線菌對(duì)5種致病菌分別表現(xiàn)出不同的抑制活性。有83.33%的內(nèi)生放線菌對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)抑制活性，有76.67%的內(nèi)生放線菌對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)抑制活性，而對(duì)大腸桿菌、黑曲霉和白色念球菌表現(xiàn)抑制活性的內(nèi)生放線菌比例較低，分別為23.33%、30.00%、1667%。其中有3株放線菌對(duì)5種指示菌有抑制作用，有1株放線菌對(duì)4種指示菌有抑制作用。

對(duì)照組（CK1）對(duì)3種細(xì)菌的平均抑菌直徑均在13～14 mm 范圍內(nèi)，抑菌圈內(nèi)清晰。F3、F19、F-L-5和F-L-7對(duì)金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯，前3株菌的平均抑菌直徑大于13 mm，活性與CK1相仿。這4株菌均對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抑制活性。對(duì)照組（CK2）對(duì)黑曲霉和白色念球菌的抑菌作用不明顯，平均抑菌直徑小于10.9 mm，且抑菌圈邊緣模糊。F19和F-L-7對(duì)黑曲霉表現(xiàn)出抑制活性，平均抑菌直徑為11.0～11.9 mm。F19和F-L-5對(duì)白色念球菌的平均抑菌直徑在12 mm以上，抑菌圈較CK2清晰。F3和F-L-7對(duì)白色念球菌及F3和F-L-5對(duì)黑曲霉無(wú)抑菌作用。擬將此4株菌作為具有應(yīng)用潛力的高活性菌株，并進(jìn)行菌種鑒定。

2.2川芎內(nèi)生放線菌活性菌株的形態(tài)特征

將4株具有抑菌活性的菌株進(jìn)行插片培養(yǎng)后，鏡檢菌絲、孢子鏈、孢子形態(tài)（圖1）。F3孢子絲直、斷裂、孢子單個(gè)或成對(duì)；F19孢子絲多圈松螺旋形，孢子卵圓形或球形；F-L-5 孢子鏈呈直或柔曲狀，孢子橢圓或球形；F-L-7孢子絲直或柔曲，孢子球形或長(zhǎng)橢圓。在不同培養(yǎng)基上各菌株表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.3川芎內(nèi)生放線菌活性菌株的生理生化特征

測(cè)試4株活性菌對(duì)9種碳源——阿拉伯糖（L-arabinose）、棉籽糖（raffinose）、甘露醇（D-mannit01）、木糖（D-xylose）、果糖（D-fructose）、鼠李糖（rhanmose）、葡萄糖（D-glucose）、[JP2]蔗糖（sucrose）、肌醇（meso-inositol）的利用情況，結(jié)果見表3?？疾炝?株活性菌的明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素上生長(zhǎng)及H2S生成等一系列生理生化指標(biāo)（表4）?？梢钥闯鯢3能使牛奶胨化，呈淡黃色，能液化明膠，不能水解淀粉與纖維素，不產(chǎn)生H2S。

F19不能使牛奶凝固、胨化，能液化明膠，能水解淀粉，不能水解纖維素，不產(chǎn)生H2S。F-L-5 產(chǎn)酸使牛奶凝固、變紅、后胨化，能水解淀粉，不能水解纖維素，不產(chǎn)H2S。F-L-7能使牛奶凝固，變淡黃色，能水解淀粉，不能在纖維素上生長(zhǎng)，能產(chǎn)H2S，使培養(yǎng)基呈類黑色。

2.416S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用試劑盒法提取活性放線菌 F3、F19、F-L-5及F-L-7 的基因組DNA，利用16S rDNA 通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為1 300～1 500 bp的清晰[JP3]條帶（圖2）。經(jīng)測(cè)序獲得長(zhǎng)度分別為1 373、1 364、1 308、1 379 bp[JP]的序列，GenBank登錄號(hào)分別為KU975441、KU975442、KU975443、KU975444。將所測(cè)序列與GenBank中已知序列進(jìn)行Blast比對(duì)，F(xiàn)3與鏈霉菌屬金色類群[Streptomyces sp. （KP126314.1）]及[Streptomycesroseogriseus（2DQ02665.1）]相似度為99%，F(xiàn)19與暗灰鏈霉菌[Streptomyces canus（AB7184118.1）]相似度為100%，F(xiàn)-L-5與腫痂鏈霉菌[Streptomyces turgidiscabies（FJ883749.1）]相似度為99%，F(xiàn)-L-7與暗色產(chǎn)色鏈霉菌[Streptomyces phaeochromogenes（KP718589.1）]相似度為99%。用MEGA5.1軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可知，F(xiàn)3在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與鏈霉菌屬相近，這與形態(tài)特征相符，但與高相似度的種存在一定的差異，而且單獨(dú)聚為1 支，故暫定為鏈霉菌屬金色類群，其具體分類地位有待進(jìn)一步確定。F19與暗灰鏈霉菌在自舉值99%水平聚為1支；F-L-5與腫痂鏈霉菌在自舉值98%水平聚為1支，F(xiàn)-L-7與暗色產(chǎn)色鏈霉菌在自舉值98%水平聚為1支。結(jié)合菌株的形態(tài)及生理生化特征，確定F19為暗灰鏈霉菌，F(xiàn)-L-5為腫痂鏈霉菌，F(xiàn)-L-7 為暗色產(chǎn)色鏈霉菌。

3結(jié)論與討論

[JP2]川芎內(nèi)生放線菌的抑菌活性考察結(jié)果表明，主要抑制對(duì)象為革蘭氏陽(yáng)性菌，而抑制革蘭氏陰性菌及真菌的作用較弱。從中選出了4株具有應(yīng)用潛力的高活性菌株，菌種鑒定結(jié)果：鏈霉菌F3初步[JP]鑒定為鏈霉菌屬的金色類群；確定F19為暗灰[JP]鏈霉菌，F(xiàn)-L-5為腫痂鏈霉菌，F(xiàn)-L-7為暗色產(chǎn)色鏈霉菌。

暗色產(chǎn)色鏈霉菌和暗灰鏈霉菌均能產(chǎn)生多種抗生素及酶[13-16]，使暗色產(chǎn)色鏈霉菌和暗灰鏈霉菌具有重要的研發(fā)價(jià)值。腫痂鏈霉菌被報(bào)道為馬鈴薯瘡痂病的致病菌之一[17]，而滕青杉報(bào)道其能產(chǎn)生肉桂酰胺[18]。川芎內(nèi)生菌腫痂鏈霉菌具有抑菌活性，其是否對(duì)川芎致病及能否產(chǎn)生肉桂酰胺類物質(zhì)有待后續(xù)研究。

目前，尚未見有關(guān)川芎內(nèi)生放線菌的研究，僅筆者所在課題組將分離自川芎的內(nèi)生放線菌作為川芎根腐病生防菌的擬開發(fā)對(duì)象[4]。本試驗(yàn)首次開展川芎內(nèi)生放線菌的抑菌活性研究，可以為開發(fā)新的抗生素提供放線菌資源。然而其最優(yōu)發(fā)酵條件、抑菌機(jī)制及活性成分等均有待進(jìn)一步研究，期望在抗菌化合物方面開發(fā)具有應(yīng)用前景的產(chǎn)品。

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