李雅博，李婷，韓瑩琰，范雙喜

（北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

葉用萵苣熱激蛋白基因LsHsp70-2711的克隆及高溫脅迫下的功能分析

李雅博，李婷，韓瑩琰，范雙喜

（北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

【目的】通過克隆Hsp70相關(guān)基因，并利用VIGS分析葉用萵苣熱脅迫下Hsp70表達(dá)量和形態(tài)變化，為解析熱激蛋白基因Hsp70在高溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制及分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^同源克隆及RACE技術(shù)，獲得葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-2711的cDNA全長(zhǎng)序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析該基因在不同溫度和不同高溫時(shí)間下的葉用萵苣熱敏品種‘P-S11’和耐熱品種‘G-S59’的表達(dá)差異，確定基因和高溫的相關(guān)性。根據(jù)VIGS技術(shù)，構(gòu)建pTRV-LsHsp702711瞬時(shí)沉默載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301，注射法侵染葉用萵苣葉片，三周后經(jīng)PCR鑒定得到陽性植株。對(duì)照組和陽性組在基因表達(dá)和形態(tài)上進(jìn)行對(duì)比，對(duì)照植株和陽性植株熱脅迫和干旱處理后再次分析LsHsp70-2711的表達(dá)特性，觀測(cè)形態(tài)變化?！窘Y(jié)果】LsHsp70-2711 cDNA全長(zhǎng)為2 226 bp，開放閱讀框?yàn)? 154 bp，編碼718個(gè)氨基酸，與擬南芥（NP_187864.1）、番茄（NP_001266213.1）、水母雪蓮花（AAB99745.1）等物種的Hsp70同源性達(dá)到80%以上，證明此基因?qū)儆贖sp70家族。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，高溫脅迫下該基因在兩個(gè)品種中的表達(dá)均上調(diào)，在耐熱品種中總體表達(dá)水平均高于熱敏品種，耐熱品種LsHsp70-2711的表達(dá)量最大值出現(xiàn)在42℃、60 min，37℃、60 min時(shí)熱敏品種基因表達(dá)量達(dá)最大值，且在42℃高溫下熱敏品種‘P-S11’中基因表達(dá)隨著脅迫時(shí)間的增加受到抑制，而耐熱品種‘G-S59’則能長(zhǎng)時(shí)間保持較高的表達(dá)水平，此結(jié)果和田間兩品種間耐熱差異表現(xiàn)相符合。亞細(xì)胞定位顯示，LsHsp70-2711主要在細(xì)胞質(zhì)中。將構(gòu)建好的載體侵入葉用萵苣，鑒定后獲得陽性植株。由定量PCR結(jié)果可知，未進(jìn)行脅迫處理的陽性植株與對(duì)照株相比，LsHsp70-2711表達(dá)量下降，莖長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)。熱脅迫和干旱處理后的陽性植株LsHsp70-2711表達(dá)量顯著低于對(duì)照植株，高溫處理對(duì)LsHsp70-2711的影響大于干旱脅迫?！窘Y(jié)論】LsHsp70-2711屬于Hsp70基因家族，其與葉用萵苣耐熱性相關(guān)。研究結(jié)果為解析葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-2711在葉用萵苣高溫抽薹方面的功能提供了理論支持。

葉用萵苣；Hsp70；基因克?。桓邷孛{迫；基因沉默

0 引言

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑、菌株

從300個(gè)葉用萵苣種質(zhì)資源中，大田篩選出具有典型抽薹特性的2個(gè)品種，即熱敏品種‘P-S11’和耐熱品種‘G-S59’。每個(gè)品種各稱取1 g種子，種子24 h催芽后播種于穴盤，待幼苗長(zhǎng)到4—5片葉時(shí)，定植后放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件：溫度25℃，光照12 000 lx，光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h。在光照培養(yǎng)箱中對(duì)幼苗進(jìn)行溫度處理，處理溫度分別為25℃（對(duì)照）、37℃、42℃，處理時(shí)間為0、15、30、60、120、180、240和300 min，取其第3、4片葉，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總 RNA快速提取試劑盒購(gòu)于艾德萊生物公司；高保真LA taq酶、克隆載體pMD19-T Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、RACE試劑盒購(gòu)于寶生物工程有限公司；Xbal I酶和Kpn I酶、T4連接酶購(gòu)于NEB生物公司；pTRV、GV3101農(nóng)桿菌載體由北京農(nóng)學(xué)院果樹系惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 葉用萵苣LsHsp70-2711的克隆 在GenBank中查找與基因同源性較高、已公布植物的Hsp70保守片段，并利用 DNAMAN軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行Hsp70-2711保守序列的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，陽性克隆送華大公司測(cè)序。表1 葉用萵苣LsHsp70-2711克隆、表達(dá)分析和Vigs載體構(gòu)建所用引物

第一，嚴(yán)格教師資格和準(zhǔn)入制度。把政治標(biāo)準(zhǔn)放在首位，突出警察學(xué)院教師既是人民教師又是人民警察的雙重身份特點(diǎn)，對(duì)新入職的教師的師德師風(fēng)進(jìn)行綜合考察和嚴(yán)格把關(guān)，不合格的堅(jiān)決不允許入職。第二，建立和完善政治輪訓(xùn)制度。為了提升教師政治素質(zhì)和培養(yǎng)實(shí)踐能力，定期在全體教師中開展政治輪訓(xùn)，通過系統(tǒng)講授黨的最新會(huì)議精神，了解黨的重大路線、方針、政策，了解黨的發(fā)展歷史，了解當(dāng)前時(shí)事熱點(diǎn)，從而進(jìn)一步提升政治素養(yǎng)，堅(jiān)定理想信念。第三，落實(shí)基層鍛煉制度。明確教師每隔一段時(shí)間到基層一線單位參加實(shí)戰(zhàn)鍛煉，切實(shí)解決教師從校門進(jìn)校門、不了解實(shí)戰(zhàn)的問題，實(shí)現(xiàn)公安院校教師和實(shí)戰(zhàn)單位民警雙向交流，推動(dòng)理論與實(shí)踐的有機(jī)結(jié)合。

Table 1 Primers used for cloning，construction of vector and gene expression of LsHsp70-2711

1.2.2 葉用萵苣LsHsp70-2711全長(zhǎng)的獲得 測(cè)序結(jié)果于NCBI上進(jìn)行比對(duì)，確定與其他植物HSP70的同源性，測(cè)序結(jié)果得到的中間片段分別設(shè)計(jì)基因5′端和3′端引物：27-5′GSP1、27-5′ GSP2和 27-3′GSP1、27-3′GSP2。引物5′端cDNA的合成和3′端cDNA的合成按照5'-Full RACE Kit和3'-Full RACE Kit試劑盒說明書進(jìn)行。UPM通用引物由RACE試劑盒提供。

1.2.3 LsHsp70-2711表達(dá)分析 根據(jù)寶生物公司Real Master Mix（SYBR Green）PCR試劑盒操作步驟進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)品cDNA和待測(cè)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。內(nèi)參及LsHsp70-2711的引物序列由Primer Premier軟件設(shè)計(jì)，目的基因特異性引物：2711-Y F、2711-Y R。按照以下程序進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反應(yīng)：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性 20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循環(huán)，每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集，最后95℃變性1 min，退火至55℃（每隔10 s上升0.15℃）后保溫1 min，接著檢測(cè)其熒光值，繪制熔點(diǎn)曲線。對(duì)‘G-S59’和‘P-S11’兩個(gè)品種不同溫度、不同時(shí)間處理的葉片組織進(jìn)行LsHsp70-2711實(shí)時(shí)熒光定量分析。以熱敏品種‘P-S11’在25℃下的葉片表達(dá)量為1，采用2-△△Ct法計(jì)算并作圖。

1.2.4 LsHsp70-2711 VIGS基因沉默體系 選取LsHsp70-2711開放閱讀框中500 bp左右的片段設(shè)計(jì)引物2711-V F和2711-V R。從葉用萵苣‘P-S11’cDNA中克隆出 500 bp左右片段。將克隆得到的質(zhì)粒和pTRV2空載體分別雙酶切（Xbal I內(nèi)切酶、Kpn I內(nèi)切酶）。T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化后篩選出陽性菌落。最后雙酶切鑒定，測(cè)序。將鑒定好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，并配置侵染液。

選取長(zhǎng)至 4片葉的‘P-S11’品種，用無菌注射器對(duì)葉片進(jìn)行注射。干旱處理：將侵染第3周植株從營(yíng)養(yǎng)土中取出，輕輕抖動(dòng)根部去除土壤，在干燥的濾紙上室溫靜置2 h。熱脅迫處理：侵染3周后，取植株在37℃下處理1 h，然后25℃正常培養(yǎng)。取侵染后第3周、2 h干旱處理和37℃熱脅迫處理植株嫩葉的cDNA，用特異引物TRV（表1），PCR擴(kuò)增，檢測(cè)TRV病毒。同時(shí)用引物2711-V（表1）對(duì)葉用萵苣 LsHsp70-2711做 RT-PCR。通過軟件Quantity One根據(jù)條帶的明暗程度進(jìn)行分析。為觀察基因沉默植株形態(tài)變化，分別測(cè)量侵染 3、4周未熱脅迫及熱脅迫處理一周后的植株莖長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

利用Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪制圖表，SPSS進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 LsHsp70-2711的克隆

通過測(cè)序獲得兩條長(zhǎng)度分別為822 bp和1 065 bp的中間片段，拼接后在NCBI上進(jìn)行同源性比較的結(jié)果表明，與水母雪蓮花、番茄、黃瓜等植物的同源性均達(dá)79%以上，初步推斷所得片段屬于Hsp70基因家族，拼接得到1 424 bp長(zhǎng)度的中間片段。后再通過5'RACE和3'RACE技術(shù)獲得Hsp70-2711的5'端和3'端序列，開放閱讀框長(zhǎng)度為2 154 bp，多次拼接后最終得到Hsp70-2711基因cDNA全長(zhǎng)序列為2 226 bp，命名該基因?yàn)長(zhǎng)sHsp70-2711。用DNAMAN軟件對(duì)所得Hsp70-2711全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行翻譯及分析，結(jié)果表明，該基因編碼一個(gè)718個(gè)氨基酸完整開放閱讀框。

2.2 葉用萵苣LsHsp70-2711的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和序列分析

使用 InterProScan在線軟件對(duì)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明，LsHsp70-2711分子量約為79.69 kD，理論等電點(diǎn)是8.58，總負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）：90，總正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）：97，在氨基酸組成中所占百分比最大的是甘氨酸 Gly（G）10.3%，最小的是組氨酸 His（H）1.4%，預(yù)測(cè)半衰期2 min（Escherichia coli，in vivo）、2 min（yeast，in vivo），不穩(wěn)定指數(shù)是35.72，小于40，所以屬于穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性系數(shù)是-0.363，因此預(yù)測(cè)為親水性蛋白。

2.3 LsHsp70-2711蛋白同源性分析

將所得氨基酸序列在NCBI上用BLAST在線軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，LsHsp70-2711與其他幾種植物的Hsp70氨基酸同源性在90%以上，進(jìn)一步推測(cè)本試驗(yàn)所得到的基因序列屬于 Hsp70基因家族。采用DNAMAN軟件分別將氨基序列與其他幾種植物進(jìn)行多重序列比對(duì)。

圖1 葉用萵苣LsHsp70-2711與其他植物Hsp70氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of plant LsHsp70-2711

利用MEGA 5.0軟件，通過NCBI的在線BLAST比對(duì)，將數(shù)據(jù)庫(kù)中已近登陸的其他物種的Hsp70氨基酸序列與本研究得到的葉用萵苣的 LsHsp70-2711氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，葉用萵苣與水母雪蓮和紫莖澤蘭屬于同一分支即親緣關(guān)系與其他植物相比更近（圖1），這一結(jié)果同在NCBI的比對(duì)結(jié)果相一致。

2.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過在線軟件Wolf psort對(duì)LsHsp70-2711蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示：細(xì)胞質(zhì)（6）、葉綠體（2）、線粒體（3）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（2）。進(jìn)一步利用在線預(yù)測(cè)軟件 TargrtP 1.1對(duì)LsHsp70-2711 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，二者結(jié)果預(yù)測(cè)顯示均主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。由此判斷，LsHsp70-2711蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.5 LsHsp70-2711基因的表達(dá)分析

iCycleriQTM自動(dòng)測(cè)出的內(nèi)參基因18S rRNA的PCR擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別為97.8 %和0.999；LsHsp70-2711擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別為108.1 %和0.996。經(jīng)熔點(diǎn)曲線分析，18S rRNA 和LsHsp70-2711兩個(gè)基因各自都只有一個(gè)Tm值，分別為87℃和80.5℃。

圖2 LsHsp70-2711在葉用萵苣熱敏品種P-S11中的表達(dá)量分析Fig. 2 Expression analysis of LsHsp70-2711 of heat-sensitive type P-S11

圖2為L(zhǎng)sHsp70-2711在葉用萵苣熱敏品種‘P-S11’中的表達(dá)結(jié)果，熱激處理15—300 min時(shí)，37℃處理組LsHsp70-2711的表達(dá)量是25℃的對(duì)照組的10倍以上，42℃處理組LsHsp70-2711的表達(dá)量是對(duì)照組的2倍以上；37℃熱激60 min的表達(dá)量是30 min的2.1倍，是120 min的4.1倍；42℃熱激15 min的表達(dá)量是熱激30 min的9.8倍。分析可知，與25℃對(duì)照相比，在37℃熱激脅迫15 min時(shí)，LsHsp70-2711在葉用萵苣品種‘P-S11’中的表達(dá)量迅速升高，同時(shí)隨著熱激處理時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；42℃熱激處理在15 min時(shí)出現(xiàn)最大值，隨后變化趨勢(shì)不明顯。兩處理表達(dá)量均明顯高于對(duì)照，說明此基因表達(dá)受高溫脅迫影響。LsHsp70-2711表達(dá)量的最大值出現(xiàn)在37℃、60 min，說明這個(gè)基因?qū)蓚€(gè)高溫處理均作出響應(yīng)，其中對(duì)37℃的高溫脅迫更顯著和更敏感。

圖 3為 LsHsp70-2711在葉用萵苣耐熱品種‘G-S59’中的表達(dá)結(jié)果，37℃熱激下，30 min時(shí)LsHsp70-2711的表達(dá)量達(dá)到最高，是15 min的13.5倍，60 min 的 2.3倍；42℃熱激下，60 min時(shí)LsHsp70-2711的表達(dá)量達(dá)到最高，是30 min的1.7倍，120 min的8倍。與對(duì)照相比，在37℃和42℃的熱激處理下，LsHsp70-2711在‘G-S59’的表達(dá)趨勢(shì)大致為先升高后降低，且表達(dá)量上也均明顯高于對(duì)照，表達(dá)趨勢(shì)與在品種‘P-S11’中的表達(dá)類似。LsHsp70-2711表達(dá)量的最大值出現(xiàn)在42℃、60 min。

圖3 LsHsp70-2711在葉用萵苣耐熱品種G-S59中的表達(dá)量分析Fig. 3 Expression analysis of LsHsp70-2711 of heat-resistant type G-S59

通過圖2和圖3對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在‘P-S11’和‘G-S59’中最大值出現(xiàn)時(shí)相對(duì)應(yīng)處理?xiàng)l件分別是 37℃的 60 min和42℃的60 min，這一結(jié)果也證明在相同時(shí)間下‘G-S59’比‘P-S11’更耐熱。在‘P-S11’中 42℃處理下的表達(dá)量只在15 min、240 min、300 min時(shí)比37℃處理時(shí)稍高，其他時(shí)間下都比37℃處理時(shí)低；而在‘G-S59’中42℃處理的表達(dá)量幾乎都比37℃下的處理高，說明熱敏品種‘P-S11’比耐熱品種‘G-S59’對(duì)高溫刺激更加敏感，更易受到高溫脅迫的傷害。此結(jié)果與試驗(yàn)過程中觀察到的在相同熱激處理?xiàng)l件下，‘P-S11’比‘G-S59’更早出現(xiàn)萎蔫和萎蔫程度更嚴(yán)重的現(xiàn)象相符合。表明LsHsp70-2711的表達(dá)受到高溫誘導(dǎo)，且該基因在耐熱品種中的表達(dá)高于熱敏品種，據(jù)此推測(cè)LsHsp70-2711的表達(dá)與耐熱性有一定的相關(guān)性。

2.6 LsHsp70-2711 VIGS基因沉默體系

2.6.1 載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 利用 LsHsp70-2711的特異性引物，以葉用萵苣的cDNA為模板擴(kuò)增出500 bp左右的片段。測(cè)序結(jié)果與LsHsp70-2711同源性100%，擴(kuò)增出的片段即為所需基因片段。將克隆獲得的質(zhì)粒和pTRV2空載體分別雙酶切，T4連接酶連接。Xbal I和Kpn I雙酶切驗(yàn)證，確定重組質(zhì)粒中含有 LsHsp70-2711片段。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用LsHsp70-2711片段特異引物PCR驗(yàn)證，獲得500 bp左右的片段，表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101中。

2.6.2 分子檢測(cè) 以空白對(duì)照和侵染植株的 cDNA為模板，用TRV的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。侵染植株的葉片中檢測(cè)出600 bp左右的條帶（圖4），未侵染 TRV 病毒的植株葉片中沒有檢測(cè)出條帶，結(jié)果表明，能檢測(cè)到病毒特異性條帶的植株葉片，說明TRV病毒已成功侵入植株中。

圖4 葉用萵苣TRV病毒檢測(cè)Fig. 4 Detection of TRV virus in lettuce

2.6.3 侵染病毒的葉用萵苣LsHsp70-2711相對(duì)表達(dá)量分析 利用RT-PCR技術(shù)對(duì)不同沉默植株LsHsp70-2711cDNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析，運(yùn)用Quantity One軟件，以Action為參照。結(jié)果表明，侵染 3周后的陽性植株 LsHsp70-2711表達(dá)量在mRNA水平上均有所降低。陽性植株中 LsHsp70-2711表達(dá)量和陰性對(duì)照相比較侵染后基因的相對(duì)表達(dá)量下降了60%，37℃處理1 h的陽性植株與陰性植株相比下降了48%。在2 h干旱處理的葉用萵苣LsHsp70-2711的相對(duì)表達(dá)量中，陽性植株的表達(dá)量比對(duì)照植株低33%，干旱陽性植株比未處理的陽性植株低10%。高溫處理和干旱處理相比，高溫處理對(duì) LsHsp70- 2711的表達(dá)影響更明顯。以上分析表明，構(gòu)建的葉用萵苣 VIGS體系能有效降低LsHsp70-2711轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量；熱激處理后的植株表達(dá)量高于未處理植株，可推測(cè)LsHsp70-2711與葉用萵苣耐熱性相關(guān)；干旱處理的植株表達(dá)量低于未處理植株，可見干旱對(duì)LsHsp70-2711的表達(dá)有抑制作用。

圖5 侵染后葉用萵苣LsHsp70-2711相對(duì)表達(dá)量

Fig. 5 Relative expression of LsHsp70-2711 in lettuce leaves

2.6.4 侵染病毒的葉用萵苣的表型性狀 從侵染第3周開始對(duì)照植株和陽性植株莖長(zhǎng)都有顯著伸長(zhǎng)。從圖6可以看出，第3周陰性對(duì)照莖長(zhǎng)略長(zhǎng)于空白對(duì)照，但兩者間沒有明顯差異。陰性對(duì)照與陽性植株的莖長(zhǎng)卻有顯著差異。第4周差異的顯著性與第3周相似，其中第3周到第4周期間葉用萵苣的莖長(zhǎng)有明顯的伸長(zhǎng)。侵染3周及熱脅迫處理的陽性植株與對(duì)照植株莖長(zhǎng)相比都有明顯增長(zhǎng)（圖7、8）。結(jié)合處理間的數(shù)據(jù)可知，不同處理期的陽性植株莖長(zhǎng)均顯著長(zhǎng)于對(duì)照植株，同時(shí)陽性植株LsHsp70-2711的相對(duì)表達(dá)量也明顯低于對(duì)照植株。由此推測(cè)，基因沉默抑制了LsHsp70-2711的表達(dá)，使葉用萵苣莖長(zhǎng)明顯伸長(zhǎng)，降低了葉用萵苣抵抗高溫的能力，LsHsp70-2711可能在葉用萵苣耐熱方面發(fā)揮重要作用。

圖6 侵染3、4周及熱脅迫處理葉用萵苣的莖長(zhǎng)Fig. 6 Stem length of lettuce in third, fourth week and heat stress

圖7 侵染3周后莖長(zhǎng)長(zhǎng)度Fig. 7 Stem of the infected leaf after three weeks

圖8 熱脅迫7 d后莖長(zhǎng)長(zhǎng)度Fig. 8 Stem of heat stress after 7 days

3 討論

目前研究表明，植物中Hsp70基因家族成員廣泛參與植物的逆境脅迫和代謝調(diào)控[27]。將本研究所得基因的氨基酸序列與其他物種Hsp70的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)同源性均在90%以上，推測(cè)本研究克隆獲得的葉用萵苣基因序列屬于 Hsp70基因家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LsHsp70-2711蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，預(yù)測(cè)結(jié)果與盧承瓊等[28]研究結(jié)果相同。

宋洪兵等[29]通過實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)分析表明，不結(jié)球白菜BcHSP70-1基因的表達(dá)量在不同耐熱性的栽培種中有較大差異。SRIKANTHBABU等[30]研究指出，經(jīng)過高溫脅迫誘導(dǎo)的豌豆幼苗內(nèi)Hsp70的mRNA量增高，而且經(jīng)過直接高溫脅迫后的豌豆幼苗中Hsp70轉(zhuǎn)錄物比經(jīng)過熱馴化的幼苗積累量少，且恢復(fù)生長(zhǎng)的速度也沒有經(jīng)過熱馴化后的幼苗快，這也說明Hsp70對(duì)提高植物的耐熱性起到一定作用。此研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似，在一定高溫處理下葉用萵苣LsHsp70-2711過量表達(dá)，說明其與葉用萵苣的耐熱性相關(guān)。在葉用萵苣熱敏型品種‘P-S11’中，LsHsp70-2711對(duì)37℃的響應(yīng)程度顯著高于42℃，在耐熱型品種‘G-S59’中LsHsp70-2711是對(duì)42℃時(shí)的響應(yīng)程度顯著高于 37℃，且耐熱品種‘G-S59’比熱敏品種‘P-S11’更耐高溫脅迫。LsHsp70-2711沉默效率較高，侵染3周的基因沉默植株表達(dá)量顯著低于對(duì)照植株，熱脅迫處理和干旱處理的沉默陽性植株表達(dá)量也顯著低于對(duì)照植株。在形態(tài)方面，熱脅迫處理和不處理的陽性植株莖長(zhǎng)都顯著大于對(duì)照植株，這與基因表達(dá)量結(jié)果相同。相對(duì)而言，葉用萵苣中LsHsp70-2711的表達(dá)在高溫處理比干旱處理更明顯。因此，從基因的表達(dá)量和形態(tài)變化上可以看出，LsHsp70-2711與葉用萵苣的耐熱性相關(guān)性較大，干旱也會(huì)有抑制作用。下一步計(jì)劃通過遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得LsHsp70-2711轉(zhuǎn)基因植株，分析基因表達(dá)情況和功能鑒定，同時(shí)結(jié)合LsHsp70-2711蛋白研究，進(jìn)一步深化認(rèn)識(shí)植物響應(yīng)高溫脅迫進(jìn)行適應(yīng)性生長(zhǎng)的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

從葉用萵苣葉片中克隆到Hsp70的同源基因，命名為L(zhǎng)sHsp70-2711。該基因開放閱讀框長(zhǎng)度為2 154 bp，編碼718個(gè)氨基酸。qRT-PCR表明LsHsp70-2711的表達(dá)受高溫誘導(dǎo)，且該基因在耐熱品種中的表達(dá)高于熱敏品種，推斷LsHsp70-2711的表達(dá)與耐熱性有一定相關(guān)性。VIGS基因沉默體系構(gòu)建證明LsHsp70-2711的沉默降低了葉用萵苣抵抗高溫的能力，熱脅迫陽性植株在表達(dá)量和表型上都顯著有別于對(duì)照植株，表明LsHsp70-2711與葉用萵苣耐熱性相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Cloning and Function Analysis of Heat-Shock-Protein LsHsp70-2711 Gene Under High Temperature Stress in Leaf Lettuce (Lactuca sativa L.)

LI YaBo, LI Ting, HAN YingYan, FAN ShuangXi
(College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

【Objective】Through cloning of genes related to Hsp70, and using VIGS to analyze Hsp70 expression and morphological change of leaf lettuce under heat stress to lay a foundation for analysis of the response mechanism and molecular mechanism of heat shock protein under heat stress.【Method】The full-length cDNA gene of LsHsp70-2711 gene was obtained byhomologous cloning and RACE technology. By real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR), the expression of the gene from P-S11and G-S59 was analyzed. According to the VIGS technology, the pTRV-LsHsp702711 vector was constructed and transformed into Agrobacterium GV1301. The leaves of lettuce were infected by the injection method. After three weeks, the positive plants were identified by PCR. The gene expression and morphology were compared between the control group and positive group, and the expression characteristics of LsHsp70-2711 were analyzed again after heat stress and drought treatment. 【Result】The sequence analysis indicated that the full-length cDNA was 2226 bp, the open reading frame was 2154 BP, encoding 718 amino acids, and its homology compared with that of Arabidopsis (NP_187864.1), tomato (NP_001266213.1), Saussurea Medusa (AAB99745.1), and other species. qRT-PCR results showed that the expression of the gene in the two cultivars was up-regulated, and the expression level of heat resistant cultivars was significantly higher than the heat sensitive cultivar, and the gene expression of P-S11 was inhibited by the increase of stress time, and the expression level of G-S59 was higher in the heat resistant variety. In heat resistant variety, the maximum expression of LsHsp70-2711 appeared at 42℃, 60 min, and the maximum expression of heat sensitive variety reached at 37℃, 60 min. Prediction of subcellular localization showed that LsHsp70-2711 was mainly in the cytoplasm. The constructed vector was used to invade the leaves of lettuce, and the positive plants were obtained after identification. LsHsp70-2711 expression decreased after it was silenced by VIGS, compared with the control, the stem length of the positive plants was significantly increased. After heat stress and drought treatment, the expression of LsHsp70-2711 was significantly lower than the control, and the influence of high temperature treatment on LsHsp70-2711 was greater than drought stress.【Conclusion】 LsHsp70-2711 gene belongs to Hsp70 gene family, and is related to the heat resistance in lettuce. The research results of the study will provide theoretical supports for the analysis of function of high temperature in bolting of lettuce.

Lactuca sativa L.; Hsp70; clone; temperature stress; VIGS

2016-09-13；接受日期：2016-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372057，31401883）、北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)（blvt—02）、北京市農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目（20140134）、北京市科技成果轉(zhuǎn)化提升計(jì)劃項(xiàng)目（PXM2015-D14207 000012）

聯(lián)系方式：李雅博，E-mail：505237137@qq.com。通信作者范雙喜，E-mail：fsx20@163.com