李海軍，于泊洋，段云嬌，劉星宇，翁婭政，杜晨光，王秀梅

（1內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018；2內蒙古醫(yī)科大學心身醫(yī)學研究室，呼和浩特 010110）

綿羊卵丘-卵母細胞復合體石蠟切片技術的改良

李海軍1，于泊洋2，段云嬌1，劉星宇1，翁婭政1，杜晨光1，王秀梅1

（1內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018；2內蒙古醫(yī)科大學心身醫(yī)學研究室，呼和浩特 010110）

【目的】在綿羊有腔卵泡發(fā)育過程中，多層卵丘細胞緊密包繞著卵母細胞形成卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complex，COCs）特殊結構，存在于卵泡腔內。卵泡成熟后，綿羊COC從卵泡內排出，進入輸卵管，等待受精?，F(xiàn)有的卵丘-卵母細胞復合體蛋白鑒定技術，或者將包含各級卵泡的卵巢組織直接進行切片處理，或者將COCs從卵泡內分離，在完整卵丘-卵母細胞復合體水平上進行免疫染色。但這兩種方法在檢測綿羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表達時，存在顯著缺陷。研究旨在對常規(guī)石蠟組織切片技術進行改進，以期滿足綿羊COCs蛋白鑒定需求。【方法】首先采用抽吸法從綿羊有腔卵泡內獲得 COCs，以石蠟包埋方式人為構建了一種可以進行切片處理的“包含多枚綿羊卵丘-卵母細胞復合體的仿組織結構”。然后以該特殊結構與健康綿羊卵巢組織為研究對象，分別采用改良與傳統(tǒng)的石蠟組織免疫化學技術流程，檢測了目的蛋白，尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator, uPA）與其受體（urokinase-type plasminogen activator recepter, uPAR），在綿羊 COCs中的表達情況，比較了兩種技術的免疫染色效果與染色流程差異?！窘Y果】將所構建的綿羊COCs仿組織結構與正常綿羊卵泡組織，進行石蠟組織切片處理，經(jīng)切片、貼片與脫蠟等步驟，分別形成了散在分布于載玻片上的COCs薄片與包含卵泡的卵巢組織薄層（厚度5μm）。經(jīng)間接免疫染色處理后，結果顯示：①目的蛋白在兩種結構COCs中的表達是一致的，即uPAR在綿羊卵丘與卵母細胞上都有表達，而uPA只存在于綿羊卵丘細胞中；②在綿羊COCs薄片結構中，COCs整體形態(tài)完好，卵母細胞與外圍卵丘細胞層次清晰，蛋白定位清楚，染色效果良好；在卵巢薄層結構中，綿羊卵泡內壁顆粒細胞與COCs等形態(tài)結構相對完整，卵母細胞蛋白定位清楚，但是卵丘細胞層次與蛋白表達較不清晰；③與綿羊卵巢組織石蠟切片技術相比較，綿羊COCs仿組織結構石蠟切片技術，在固定、脫水、透明、浸蠟以及脫蠟等步驟的處理時間都大大縮短，例如固定處理由24h縮短為2h；由逐級脫水的10h縮短為兩級脫水的1h；透明由30min縮短為10min；軟蠟與硬臘浸入由原來的6h縮短為1h；由逐級脫蠟的25min縮短為兩級脫蠟的10min等?！窘Y論】改進后的COCs仿組織石蠟切片染色技術，顯示更優(yōu)質的免疫定位與染色效果，不僅具有COCs獲得率高、卵母與卵丘細胞形態(tài)層次清晰等優(yōu)點，而且顯著縮短了操作時間，簡化了操作流程。該技術在保留COCs結構完整的基礎上，有效檢測了目的蛋白在綿羊卵丘-卵母細胞復合體中的表達模式，對于探明綿羊卵泡發(fā)育與卵母細胞成熟機制，具有重要意義。

綿羊；卵丘-卵母細胞復合體仿組織；卵巢組織；石蠟切片；蛋白表達

0 引言

【研究意義】哺乳動物有腔卵泡是動物發(fā)情期后出現(xiàn)的一種特定發(fā)育階段卵泡。此時期卵泡內，卵母細胞外包被多層卵丘細胞，僅以部分卵丘顆粒細胞與附著于卵泡內膜上的壁顆粒細胞相連，以卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complexes, COCs）的特殊形態(tài)突出于卵泡腔內的卵泡液中。隨著卵泡的持續(xù)發(fā)育與優(yōu)勢化，成熟卵泡破裂，COCs被排入輸卵管，然后停留在輸卵管壺腹部等待受精[1-2]。在有腔卵泡階段，卵丘細胞以間隙連接等方式與卵母細胞進行營養(yǎng)傳遞與信息交流。兩者間的連接結構以及在此基礎上進行的信息交流與功能互作是卵母細胞成熟的根本保障[3-4]。故此，在保留COCs結構完整的基礎上，探討某類目的蛋白在卵母細胞與卵丘細胞中的協(xié)同表達或者分泌模式，對于揭示卵泡發(fā)育與卵母細胞成熟機制，具有重要的方法學意義?！厩叭搜芯窟M展】綿羊卵丘卵母細胞復合體（COCs）是包含兩類細胞（卵母和卵丘細胞）的特殊結構，不屬于組織，無法進行切片處理，所以通常的做法是當它仍保留在卵巢組織內的時候，進行組織切片處理，被稱為免疫組織化學技術[5-8]；或者分離COCs后，在完整細胞水平上進行免疫檢測[9-11]，亦稱為免疫細胞化學技術。但是這兩類技術在研究卵丘與卵母細胞互作機制，即探討目的蛋白在（保留完整COCs結構前提下）卵丘與卵子協(xié)同表達情況時，存在顯著缺陷。由于COCs是一類由多層卵丘細胞與一層均質透明帶包被卵母細胞的復合結構，在常規(guī)免疫細胞化學技術條件下，一抗與帶標記基團二抗很難進入該復合結構的深層卵丘或卵母細胞內部，致使卵丘細胞與卵母細胞中待檢抗原標記困難[12]。為了解決這一問題，研究者通常采用蝸旋或者機械吹打COCs的方法，在獲得半裸露的COCs的前提下進行免疫染色[13-14]。但是這樣處理毫無疑問會破壞掉大部分COCs中卵母與卵丘細胞間完整的連接結構，給后續(xù)研究帶來影響。免疫組織化學技術以石蠟包埋或者冰凍方式處理固定組織塊，切片后，利用免疫技術標記組織各細胞中特定蛋白。在有關各級卵泡蛋白鑒定的研究中，免疫組織化學作為常規(guī)技術,其優(yōu)點在于可以檢測某種蛋白在卵泡各類細胞中的協(xié)同表達情況[15-16]，細胞層次感好，組織形態(tài)完美，可供回顧性研究[17]。但是在有腔卵泡內，由于隨著卵泡的不斷發(fā)育，連接COCs與卵泡壁之間的部分卵丘顆粒細胞變得愈加松散。所以利用該技術檢測COCs中蛋白表達時存在諸多缺點，如：卵泡不易切到；切到卵泡但是COCs或者卵母細胞極易丟失；工作量巨大等[18]?！颈狙芯壳腥朦c】為了探討將常規(guī)組織切片技術用于細胞（綿羊COCs）蛋白表達檢測的可行性，本研究將多個COCs取出后進行石蠟包埋，形成可以進行切片制作的綿羊COCs仿組織結構，并與健康綿羊卵巢進行比較，分別采用改良與傳統(tǒng)的免疫組織化學技術流程，通過對比目的蛋白，尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator, uPA）與其受體（urokinase-type plasminogen activator recepter, uPAR），在卵母與卵丘細胞上的表達，驗證其有效性?！緮M解決的關鍵問題】兩種技術檢測目的蛋白在綿羊COC中表達的情況是否有差異？與常規(guī)綿羊卵巢組織石蠟切片技術相比較，基于綿羊COCs的石蠟切片技術是否具有更好的染色效果與檢測流程？

1 材料與方法

本研究于2015年6—11月間在內蒙古呼和浩特內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院發(fā)育生物學與胚胎工程研究室實施。

1.1 主要儀器與試劑

體視顯微鏡（SZX16，OLYMPUS），臺式離心機（CENTRIFUGE，HITACHI），電熱恒溫水浴鍋（HW-SY11-K，北京長風），倒置顯微鏡(IX71，OLYMPUS)，MINI離心機（AG22331，Eppendorf ），潔凈工作臺（SW- CJ-2，蘇凈安泰），電子天平（BSA2245，Sartorius），高壓滅菌器(SX-500，TOMY)，激光共聚焦顯微鏡(M487E，Nikon)，切片機（CM1900，Leica）。

多聚甲醛（solarbio），Trition-X100（Coolaber），dPBS（HyClone），兔抗人一抗 uPA（urokinase-type plasminogen activator antibody，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.），鼠抗人一抗 uPAR（urokinase-type plasminogen activator receptor antibody, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.），驢抗兔二抗（Donkey-Antibody-Rabbit-Alx647，Jackson Immuno Research LABORATORIES, INC），驢抗鼠二抗（Donkey-Antibody-Mouse-Alx488，Jackson Immuno Research LABORATORIES, INC ），多聚賴氨酸載玻片（NobleRyder，Beijing），驢封閉血清，0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0），以及其他無機鹽均采用Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 綿羊離體卵巢獲得與綿羊COCs收集

從被屠宰母綿羊體內取得卵巢后，置于30—35℃生理鹽水中，于3 h內送至實驗室。一部分卵巢留作免疫組織化學檢測之用；另一部分用于獲取綿羊COCs。

用帶有18號針頭的注射器抽取直徑2—5 mm卵泡中的卵泡液和 COCs, 置于滅菌培養(yǎng)皿中, 在立式顯微鏡下?lián)斐霾⑹占?層以上有致密卵丘細胞層及卵胞質均勻的COCs。

1.3 “新型綿羊卵丘-卵母細胞復合體仿組織”免疫化學染色

1.3.1 “新型綿羊卵丘-卵母細胞復合體仿組織”的構建與切片制作

固定：將50—60枚綿羊COCs在4%多聚甲醛溶液中固定2h;

脫水：將綿羊COCs在50%酒精與無水乙醇中兩級脫水，各孵育30min；

透明：將綿羊COCs轉入二甲苯中透明10min；

浸蠟：將COCs吸入到1.5mL的EP管中，在60℃熔蠟箱內，先后用軟蠟與硬蠟浸入各 30min，軟蠟與硬蠟浸入量以能覆蓋全部復合體為宜；

“組織”構建與包埋：將沉浸在硬蠟中的 COCs群體，從 EP管內吸出，注入包埋箱，常溫下包埋，形成了由固化石蠟聚集多枚COCs于1cm3空間內的“仿組織結構”。

切片與貼片：將構建好的“仿組織”蠟塊固定于切片機上，切成厚度為5μm薄片，貼到載玻片上，放50℃恒溫箱中烘干。

1.3.2 抗體孵育與染色流程 在 AL-SAMERRIA等[19-20]與方法基礎上稍加改良, 對綿羊 COCs仿組織進行間接免疫染色處理。具體流程如下：

脫蠟處理：二甲苯與無水乙醇分別各孵育10min；

封閉：滴加 5%驢封閉血清，濕盒內室溫封閉30min；

一抗孵育：同時滴加Rabbit anti human uPA抗體/ Mouse anti-human uPAR抗體（1﹕100），濕盒內室溫放置1 h或4℃冰箱過夜；陰性對照組不加一抗，dPBS漂洗3次（5min/次）；

二抗孵育：滴加 donkey anti-Rabbit / donkey anti-mouse 兩種熒光二抗，暗盒室溫孵育1h，避光條件下，用dPBS漂洗3次（5min/次）；

照相：用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察照相。

1.4 綿羊卵巢組織免疫組織化學染色

1.4.1 綿羊卵巢組織切片制作 參考杜晨光等[21]提供的方法，制作綿羊卵巢組織切片。具體流程如下：

固定：剪掉新鮮卵巢上附帶的輸卵管和系膜，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h左右；

脫水：棄去固定液,流水沖洗固定組織5 h, 依次浸入梯度酒精脫水[70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精（二次）→無水乙醇（二次）]，每次2 h；

透明：將卵巢放入預透明溶液（50%二甲苯+50%無水乙醇）內孵育40 min，二甲苯內透明40 min；

浸蠟：在60℃熔蠟箱內，先后用軟蠟與硬蠟浸入卵巢組織各3 h，軟蠟與硬蠟浸入量要能覆蓋組織塊；

包埋：將卵巢組織連同硬蠟放入包埋盒，室溫放置30min，凝固包埋。

切片與貼片：將卵巢蠟塊固定于切片機上，切成厚度為5 μm薄片，貼到載玻片（多聚賴氨酸片）上，放50℃恒溫箱中烘干1 h。

1.4.2 抗體孵育及染色流程 依據(jù) AL-SAMERRIA等[19-20]的方法, 對綿羊卵巢組織切片進行間接免疫染色處理。具體流程如下：

脫蠟處理：二甲苯 5 min→ 無水乙醇 5 min→95%酒精5 min→ 85%酒精5min→ 80%酒精5min→75%乙醇5min。

抗原修復：0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖溶液加熱10—15min，dPBS漂洗3次（5min/次）。

封閉：滴加 5%驢封閉血清，濕盒內室溫放置30min，dPBS漂洗3次（5min/次）。

一抗孵育：同時滴加Rabbit anti human uPA抗體/ Mouse anti-human uPAR抗體（1﹕100），濕盒內室溫放置1 h或4℃冰箱過夜；陰性對照組不加一抗，dPBS漂洗3次（5min/次）。

二抗孵育：滴加 donkey anti-Rabbit / donkey anti-mouse 兩種熒光二抗，暗盒室溫孵育1h，避光條件下，用dPBS漂洗3次（5min/次）。

照相：用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察照相。

2 結果

2.1 “新型綿羊卵丘-卵母細胞復合體仿組織”免疫化學染色

本研究以石蠟包埋方式人為構建了一種可以進行切片處理的包含多個綿羊COCs的“新型卵丘卵母細胞復合體仿組織”結構，經(jīng)切片、貼片以及脫蠟處理以后，事實上形成了散在分布于載玻片上的單個 COCs薄片結構（5μm）。免疫化學染色結果顯示，綿羊COCs形態(tài)完好，卵母細胞與外圍卵丘細胞結構完整；卵母細胞與卵丘細胞層次清楚，蛋白定位清晰，染色效果良好（圖 1）。結果表明，uPAR在綿羊卵丘與卵母細胞上都有表達，而 uPA只存在于卵丘細胞中。

2.2 綿羊卵巢組織免疫組織化學染色

利用石蠟組織切片技術，獲得包含卵泡的卵巢組織。經(jīng)切片、貼片與脫蠟等處理后，形成貼附于載玻片上的包含卵泡內結構的一薄層卵巢組織（5μm）。免疫染色結果顯示，綿羊卵泡內壁顆粒細胞與 COCs等形態(tài)結構保持完整；卵母細胞蛋白定位清晰，但是卵丘細胞層次與蛋白定位表達不夠清楚（圖 2）。兩類技術在COCs中取得一致結果，即：uPAR在綿羊卵丘與卵母細胞上都有表達，而uPA只存在于綿羊卵丘細胞中。

2.3 兩類免疫化學技術染色流程差異

本研究創(chuàng)建了一種綿羊卵丘卵母細胞復合體仿組織，對傳統(tǒng)的石蠟組織切片免疫染色技術流程作了改進。兩種染色流程的差異對比顯示（表 1），改進后的COCs仿組織石蠟切片染色技術具有簡化操作流程與縮短操作時間等明顯優(yōu)點。

3 討論

本研究利用兩種石蠟組織切片免疫技術分別檢測了uPA與其受體uPAR蛋白在未成熟綿羊COCs中的協(xié)同表達情況。結果顯示，兩種技術檢測到的uPA與uPAR蛋白表達情況是一致的，即uPAR在綿羊卵丘與卵母細胞上都有表達；uPA只存在于卵丘細胞中，在綿羊卵母細胞中不表達。有研究報道，多種動物的卵丘細胞在體外成熟過程中表達uPA蛋白[22-23]。這些研究報道與本研究結果相類似。在小鼠和大鼠上的相關研究顯示，無論是來自發(fā)育中卵泡的卵母細胞還是已成熟卵母細胞，都不表達uPA[24]。PARK等[25]在處于成熟進程牛卵母細胞中檢測到了活性uPA，但是他們同樣認為剛從有腔卵泡獲得的卵母細胞中不存在活性uPA。這些前人報道在一定程度上佐證了本研究關于綿羊未成熟卵母細胞不表達 uPA蛋白的檢測結果。另外，雖然uPAR在綿羊卵泡細胞中的表達尚未見報道，但是 GARCíA等[26]發(fā)現(xiàn)uPAR在成熟與未成熟牛卵母細胞中均有表達。由于uPA活性只能通過其前體與uPAR結合才能表現(xiàn)出來[27]，故此推測綿羊COCs中也應表達uPAR。綜上，本研究成功構建了一種在保留綿羊COCs完整結構前提下有效鑒定卵丘與卵母細胞中蛋白表達的新方法。

圖1 uPA和uPAR蛋白在綿羊卵丘-卵母細胞復合體中表達Fig.1 Expression of uPA and uPAR proteins in bovine cumulus-oocyte complex

圖2 綿羊有腔卵泡內uPA和uPAR蛋白的表達Fig.2 Expression of uPA and uPAR proteins in one bovine antral follicle

表1 兩類免疫技術染色流程差異比較Table 1 Difference comparison between two staining procedures

與綿羊卵巢組織石蠟切片免疫染色技術相比較，本研究構建的綿羊COCs仿組織石蠟切片免疫染色方法顯示更優(yōu)質的免疫定位與染色效果，包括綿羊COCs結構更為完整，卵母與卵丘細胞形態(tài)清楚，層次分明，蛋白定位更清晰。綿羊卵巢皮質主要由不同發(fā)育階段卵泡和結締組織組成，其中有腔卵泡由外及內包含 5類結構：卵泡外膜與內膜、壁顆粒細胞層、卵泡液、卵丘細胞層和卵母細胞[28]。在傳統(tǒng)卵巢組織石蠟切片制作過程中，首先要將卵巢或者切成一定大小的卵巢塊進行固定、脫水、透明與浸蠟等步驟處理，由于卵巢結構成分復雜，對上述步驟要求精細，染色效果難以完美保真[29]。而本研究構建的綿羊 COCs仿組織石蠟切片技術，是在綿羊COCs基礎上進行上述處理。綿羊COCs僅包括數(shù)層卵丘細胞與其內部卵母細胞兩種結構，結構簡單，細胞成分明確，固定、脫水、浸蠟等步驟處理簡單，易于取得良好效果。這些可能是新方法染色效果優(yōu)于傳統(tǒng)技術的一個重要原因。另外，新技術將多個綿羊 COCs灌注包埋，切片之后，卵母細胞形態(tài)完好，外圍卵丘細胞層次清晰，COCs獲得率高；而傳統(tǒng)的卵巢切片中，由于有腔卵泡位于卵巢局部，且有腔卵泡內將 COCs固定于卵泡壁上的細胞結構較為松散，所以在切片過程中，有腔卵泡不易切到，而且即使切到有腔卵泡層面，COCs或者卵母細胞也較易丟失。

本研究中兩種染色流程差異對比顯示，改進后的COCs仿組織石蠟切片染色技術具有簡化操作流程與縮短操作時間等明顯優(yōu)點。與綿羊卵巢組織石蠟切片技術相比較，新型綿羊COCs仿組織石蠟切片技術，在固定、脫水、透明、浸蠟以及脫蠟等步驟的處理時間都大大縮短，例如固定處理，由24 h縮短為2 h；由逐級脫水的10 h縮短為兩級脫水的1 h等；同時還省略了卵巢切片的抗原修復步驟。由于綿羊COCs細胞成分簡單，所以固定、脫水、浸蠟與脫蠟等步驟處理毋需過多耗時，即可取得較好效果。另外，為避免卵巢組織中復雜未名成分對多聚甲醛封閉待檢抗原可能的促進作用，抗原修復成為傳統(tǒng)石蠟組織切片技術中的必要步驟[30]。本研究對于經(jīng)多聚甲醛固定的COCs石蠟切片未作抗原修復處理，但由于缺少抗原修復對比試驗，所以該操作流程中是否可以省略抗原修復這一步驟，尚需進一步實驗驗證。

4 結論

本研究建立了一種綿羊卵丘-卵母細胞復合體仿組織石蠟切片染色技術。本技術在保留卵丘-卵母細胞復合體結構完整的基礎上，能夠有效檢測目的蛋白在綿羊卵母細胞與卵丘細胞中的協(xié)同表達或者分泌模式，對于探明綿羊卵泡發(fā)育與卵母細胞成熟機制，有重要意義。

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（責任編輯 林鑒非）

A Modified Paraffin-Section Technique for Ovine Cumulus-Oocyte Complexes

LI HaiJun1，YU BoYang2，DUAN YunJiao1，LIU XingYu1，WENG YaZheng1，DU ChenGuang1，WANG XiuMei1
（1College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018；2Psychosomatic Medicine Laboratory , Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110）

【Objective】 During the ovine antral follicle development, the multilayer cumulus cells closely surround the oocyteto form a special structure named cumulus-oocyte complex (COC), existing in the follicular cavity. The ovine COC will be discharged tube from the mature follicle into the fallopian to be fertilized. The existing technologies for protein identification in COC choose the ovarian tissue containing follicles to be sliced up or to immunostain the whole COC after the COC isolated from the follicle. However, there are significant defects when using the two methods to detect protein expression in ovine COC from the antral follicle. In the present study, the conventional paraffin section technology was improved so as to meet the demand of ovine COC protein identification. 【Method】 The COCs were obtained from the antral follicles by aspiration, and the special structure containing multiple ovine COCs was created by paraffin embedding. Together with the healthy ovarian tissue, the target protein expression, urokinase-type plasminogen activator (uPA) and urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR), were identified in the COCs structure and the immunostaining effects and procedures were compared between the modified and conventional paraffin immunohistochemical technologies. 【Result】 The samples of ovine COCs and ovaries were obtained by paraffin embedding. The single COC sheets distributed in glass slides and the thin ovarian layer (5μm) was formed following sectioning, plastering and dewaxing. The indirect immunostaining results showed that, ① The target protein expression was consistent in the two types of COCs, which revealed that uPAR was expressed in both bovine cumulus and oocyte, while uPA was only expressed in cumulus. ② In the COC section, a well-preserved bovine COC structure with well-defined layers and easily identified protein location in either the oocyte or cumulus was observed. In the ovarian section, the follicle remained intact, and the clear protein localization in oocyte could be observed; however, cumulus layers and its protein localization were unclear. ③A comparison of the staining procedures between the both methods described herein showed that ovine COCs paraffin-sectioning technique provided a more simplified process and significantly shorter handling for fixation, dehydration, transparent processing, waxing and dewaxing. For example, fixation was shortened from 24 h to 2 h; dehydration was converted from the granual steps of 10 h to the two-step of 1 h; transparent processing was shortened from 30 mins to 10mins; waxing and dewaxing were simplified from 6 h to 1 h, and from the granual steps of 25 mins to the two-step of 10 mins, respectively. 【Conclusion】 The modified COCs paraffin sectioning technique showed a better immunostaining effect and featured the higher generation rate for COCs, the clearer outline of oocyte and cumulus cells, and the more simplified operation process. Based on the complete COCs structure, this new technology effectively detected the target protein expression in ovine COCs, with great methodological significance to reveal the developing mechanism of ovine follicles.

sheep; cumulus-oocyte complexes-like tissue; ovarian tissue; paraffin section; protein expression

2016-11-28；接受日期：2017-02-24

國家自然科學基金（31060165;31360283；31660701）、內蒙古自然科學基金（2012MS0411）

聯(lián)系方式：李海軍，E-mail：navy1973@163.com。通信作者王秀梅，E-mail：wangxiumei62@163.com