李冬

(盤錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)分院，遼寧盤錦124000)

EV71感染對手足口病患兒DCs成熟、凋亡及MAPK信號通路和炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

李冬

(盤錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)分院，遼寧盤錦124000)

目的 探究腸道病毒71型(EV71)感染對手足口病患兒樹突狀細(xì)胞(DCs)成熟、凋亡及MAPK信號通路和炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法 選擇手足口病患兒40例，根據(jù)感染程度將患兒分為輕癥感染組(20例)、重癥感染組(20例)，另選取同期同年齡段健康兒童20例作為對照組。抽取各組DCs體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)后檢測表面標(biāo)志的變化、細(xì)胞凋亡情況及MAPK信號通路活化情況，并對細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果 輕度感染組、重度感染組CD80、CD83及CD86陽性率隨感染程度的加重而上升，其中CD80、CD83與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。對照組凋亡細(xì)胞檢出率及死亡細(xì)胞檢出率在三組中最高；輕度感染組凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞檢出率與對照組相比降低；重度感染組凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞檢出率最低；三組細(xì)胞凋亡率及死亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。輕度感染組、重度感染組p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量均隨感染程度加深而增加(P均<0.05)。IL-6及IL-12表達(dá)隨感染程度的加重而呈上升趨勢，其中IL-6變化明顯，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，IL-12略有升高，三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；TNF-α表達(dá)隨感染程度的加重呈先升高后降低的趨勢，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 EV71感染可促進(jìn)DCs成熟并分泌細(xì)胞因子，同時抑制其凋亡，活化MAPK信號通路，上調(diào)炎性細(xì)胞因子表達(dá)。

腸道病毒71型；樹突狀細(xì)胞；MAPK信號通路;炎性細(xì)胞因子

腸道病毒71型(EV71)是兒童手足口病的主要致病源[1]，其感染人數(shù)逐年上升。EV71感染所致手足口病起病急、發(fā)展快[2]，輕度感染患兒預(yù)后良好，重度感染患兒多伴隨腦膜炎等并發(fā)癥[3]，且致殘致死率高。目前針對該類手足口病尚無有效的疫苗及藥物。研究顯示EV71可使感染患兒體液免疫系統(tǒng)紊亂[4]，并通過感染樹突狀細(xì)胞導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子表達(dá)改變。2014年12月，我們通過比較手足口病不同感染階段兒童樹突狀細(xì)胞(DCs)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)后成熟及凋亡情況、MAPK信號通路活化情況及炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化情況，以期為EV71型手足口病疫苗的研究及開發(fā)提供更多參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年6～12月我院收治并確診的手足口病患兒40例作為感染組,男22例、女18例,年齡10個月～9歲。根據(jù)《手足口病診療指南(2010年版)》對患兒進(jìn)行診斷并評估病情，其中20例為輕度感染患兒(輕度感染組)，20例為重度感染患兒(重度感染組)。另選取同期同年齡段健康兒童20例作為對照組。感染組及對照組兒童年齡、性別具有可比性。均于入院24 h內(nèi)采集外周血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中。

1.2 DCs分離培養(yǎng) 裂解外周血血漿中紅細(xì)胞，離心獲得單個核細(xì)胞(PMBC)。吸出的PMBC經(jīng)無血清RPMI1640洗滌并以2×106/mL接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)2 h。輕柔洗去未貼壁細(xì)胞，余下即為單核細(xì)胞。單核細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基(RPMI1640+10%FBS)、100 U青鏈霉素抗生素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，并加入100 ng/mL 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、50 ng/mL IL-4以誘導(dǎo)DCs分化。2～3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7 d后收獲。

1.3 DCs表面標(biāo)志物細(xì)胞數(shù)檢測 取感染組及對照組誘導(dǎo)培養(yǎng)后DCs直接用熒光抗體染色標(biāo)記，抗體為PE標(biāo)記的鼠抗人CD11c、CD80、CD83、CD86，陰性對照采用PE標(biāo)記的鼠抗人Ig。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞陽性比例，對單核細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析，根據(jù)免疫表型分析結(jié)果比較兩組DCs成熟度。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 采用Annexin V/PI雙染色法對誘導(dǎo)培養(yǎng)后的DCs凋亡情況進(jìn)行檢測。取感染組及對照組誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞各490 μL，每組加入FITC-Annexin V 5 μL和PI 5 μL,避光溫浴10 min，PBS洗滌。每組取1×105個細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。在488 nm氬離子激光器下，F(xiàn)ITC呈綠色熒光，PI呈紅色熒光。保存流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，并用相關(guān)分析軟件進(jìn)行結(jié)果處理。

1.5 信號通路蛋白檢測 各取感染組和對照組誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞5×106個，裂解細(xì)胞并提取總蛋白，用Western blotting法檢測兩組細(xì)胞p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)情況，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白磷酸化水平，將各樣品p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量與對應(yīng)GAPDH相除，得到相對表達(dá)量。

1.6 外周血炎性細(xì)胞因子檢測 收集感染組及對照組的細(xì)胞上清液，采用雙抗夾心ELISA法對外周血中細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測。檢測的細(xì)胞因子包括IL-6、IL-12及TNF-α。

2 結(jié)果

2.1 EV71感染對DCs成熟的影響 誘導(dǎo)培養(yǎng)后的對照組細(xì)胞多為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞無毛刺樣凸起；感染組細(xì)胞多為懸浮細(xì)胞，細(xì)胞周圍有毛刺樣凸起產(chǎn)生，且毛刺較長。三組DCs表面標(biāo)志物檢測結(jié)果比較見表1。

表1 三組DCs表面標(biāo)志物檢測結(jié)果比較(%，±s)

2.2 EV71感染對DCs凋亡的影響 Annexin V/PI雙染色法中早期凋亡細(xì)胞可被FITC染色，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞可被PI染色。對照組、輕度感染組、重度感染組細(xì)胞凋亡率分別為(54.89±7.10)%、(30.18±5.33)%、(16.41±1.39)%，死亡率分別為(21.77±6.13)%、(14.25±5.37)%、(1.56±0.73)%，三組細(xì)胞凋亡率及死亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 三組EV71感染后信號通路活化情況比較 見表2。

2.4 三組細(xì)胞因子定量檢測結(jié)果比較 見表3。

3 討論

EV71導(dǎo)致的兒童手足口病癥狀較其他病毒引發(fā)的疾病更嚴(yán)重，部分患兒會產(chǎn)生嚴(yán)重后遺癥。目前臨床主要為抗病毒化學(xué)藥物及細(xì)胞因子等治療，效果不佳。因此，制備有效的抗病毒疫苗成為EV71防治的重心。DCs是體內(nèi)最重要的抗原遞呈細(xì)胞，未成熟DCs的主要功能為攝取加工抗原及隨體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)遷移，成熟DCs負(fù)責(zé)遞呈抗原以刺激T細(xì)胞增殖并激活免疫系統(tǒng)[5]。病毒感染機(jī)體后首先遇到的就是DCs[6]，DCs可被病毒感染，亦能攝取病毒感染的細(xì)胞，同時又是機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的激活者[7]。CD83作為成熟DC特有的表面標(biāo)志，通常被用來識別和分離成熟DCs；CD86、CD80、CD11c亦是成熟DCs表達(dá)的重要共刺激因子，其表達(dá)量上調(diào)代表DCs成熟[8]程度的加深。本研究中，輕度感染組、重度感染組各標(biāo)志物的表達(dá)均高于對照組，其中CD83、CD80的上調(diào)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明EV71感染對DCs成熟起到明顯促進(jìn)作用。成熟DCs在激活機(jī)體免疫系統(tǒng)的同時分泌各種炎性細(xì)胞因子，參與免疫應(yīng)答并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9]。本實驗結(jié)果表明，隨感染程度的加深，IL-6、IL-12均顯著增加，而TNF-α在感染初期表達(dá)水平較高，而在重度感染時反而出現(xiàn)降低現(xiàn)象。炎性因子的增加又可繼續(xù)刺激DC細(xì)胞成熟，成熟DCs可能對EV71繁殖有抑制作用[10]。而重度感染時TNF-α表達(dá)下降，推測是由于DCs成熟程度較高，對TNF-α產(chǎn)生了負(fù)反饋而導(dǎo)致。彭宏君等[11]發(fā)現(xiàn)，感染可促進(jìn)DCs成熟、提高體外培養(yǎng)DCs活性并增強(qiáng)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，與本實驗結(jié)果一致。

表2 三組p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量比較(±s)

表3 三組細(xì)胞因子定量檢測結(jié)果比較(pg/mL，±s)

研究[12]表明，p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與介導(dǎo)DCs的凋亡。p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白均為此信號通路的重要節(jié)點，其含量上調(diào)，表明此信號通路被激活。本實驗中，隨感染程度的加深，p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白含量隨之上升，表明此信號通路參與介導(dǎo)的促細(xì)胞凋亡信號在增強(qiáng)。而細(xì)胞生存能力實驗卻表明，隨感染程度的加深，DCs的生存狀況反而較優(yōu)。原因可能EV71感染后機(jī)體由于應(yīng)激反應(yīng)，DCs細(xì)胞趨向成熟，以刺激T細(xì)胞對抗病毒。DCs對初始T細(xì)胞的增殖活化起關(guān)鍵作用，因此隨感染程度的加深細(xì)胞死亡及凋亡率降低，這是機(jī)體抵御病毒感染的自然反應(yīng)。EV71感染未成熟DCs激活細(xì)胞凋亡信號通路，但由于本研究是將已被病毒感染患兒的單核細(xì)胞提出體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，未成熟的DCs在體外無持續(xù)病毒感染情況下被誘導(dǎo)成熟，因此導(dǎo)致雖然信號通路開啟，但細(xì)胞凋亡及死亡率降低。

綜上所述， EV71感染可促進(jìn)DCs成熟并分泌細(xì)胞因子，同時抑制其凋亡，活化MAPK信號通路，上調(diào)炎性細(xì)胞因子表達(dá)。

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