人參皂苷Rg1通過NF-κB阻斷缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞EMT

劉 丹，劉 婷，趙 樂，李 旭

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，陜西 西安 710061)

人參皂苷Rg1通過NF-κB阻斷缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞EMT

劉 丹1，劉 婷1，趙 樂2，李 旭2

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，陜西 西安 710061)

目的 探討人參皂苷Rg1對卵巢癌SKOV3細胞上皮間質轉化的影響及機制。方法 確定人參皂苷Rg1對SKOV3細胞生長的影響，構建缺氧誘導上皮間質轉化(EMT)模型，觀察細胞形態(tài)變化，檢測E-cadherin，vimentin及核因子KappaB(NF-κB)蛋白的表達。結果 不同濃度的人參皂苷Rg1處理SKOV3細胞，超過40μg/mL的Rg1培養(yǎng)24h時對細胞生長稍有抑制，培養(yǎng)48h和72h時對細胞生長無明顯抑制。缺氧誘導48h，SKOV3細胞呈現(xiàn)紡錘形、松散排列的形態(tài)，E-cadherin蛋白表達消失，vimentin蛋白表達增強。40μg/mL人參皂苷Rg1處理缺氧誘導的SKOV3細胞48h，細胞形態(tài)變化被部分逆轉。E-cadherin蛋白表達恢復，vimentin蛋白表達被抑制，同時，NF-κB蛋白的表達與E-cadherin呈相反的趨勢。結論 人參皂苷Rg1可能通過調控NF-κB抑制缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞的EMT。

人參皂苷Rg1；上皮間質轉化；E-鈣黏素；波形蛋白；核因子KappaB

卵巢癌是女性生殖器官常見惡性腫瘤之一，由于缺乏早期診斷方法，且易發(fā)生早期轉移及擴散，中晚期卵巢癌的死亡率一直居高不下[1]。上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉移侵襲的一種重要機制[2-3]，指具有極性的上皮細胞在某種環(huán)境下從緊密連接的上皮細胞形態(tài)轉換為間質細胞形態(tài)，細胞失去極性，細胞間黏附減弱，運動功能增強。上皮細胞標志物如E-鈣黏素(E-cadherin)表達減弱，而間質細胞標志物如波形蛋白(vimentin)表達增強。多項研究已證實通過抑制EMT過程，卵巢癌細胞的轉移和侵襲都被抑制[4-6]。核因子KappaB(NF-κB)是一種普遍存在的多功能轉錄因子，其在腫瘤發(fā)生中的作用已被公認。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB高表達與上皮性卵巢癌化療耐藥及預后不良有關，NF-κB可調控上皮表型相關抑制基因的轉錄，還可促進間質細胞特征的出現(xiàn)和維持，促進和保持細胞呈現(xiàn)侵襲的表型[7-8]。因此，NF-κB信號通路可能是卵巢癌細胞EMT中的一個重要分子。

人參皂苷Rg1是中藥人參提取物中含量最高的單體[9]，可清除自由基、對抗氧化應激、減少凋亡，能有效減輕細胞的缺血再灌注損傷及皮膚的紫外線損傷[10-13]。Yu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可抑制轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導下肝癌HepG2細胞的EMT過程，從而減弱細胞的侵襲和轉移。Li等[15]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可通過抑制NF-κB依賴的基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)表達，從而抑制向二乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)誘導下乳腺癌MCF-7細胞的侵襲和轉移。然而，人參皂苷Rg1在卵巢癌侵襲轉移中的作用鮮有報道。

本研究擬通過構建人卵巢癌SKOV3細胞缺氧模型，誘導細胞發(fā)生EMT，探討人參皂苷Rg1對卵巢癌細胞EMT的影響，并初步證實NF-κB在其中的作用。

1資料與方法

1.1細胞培養(yǎng)及缺氧模型的建立

人卵巢癌細胞SKOV3(中科院上海細胞庫)常規(guī)培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，內含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(美國GIBCO公司)，及含100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(Model3111，美國Forma公司)。缺氧處理時將SKOV3細胞放入HF100三氣培養(yǎng)箱(HF100，香港Heal Force公司)中以1% O2, 5%CO2, 94% N2，37℃, 100%濕度條件進行培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。缺氧處理前加入干預藥物后立即放入三氣培養(yǎng)箱進行缺氧，處理48h后取出細胞迅速進行蛋白提取處理。

1.2細胞增殖力檢測

將對數(shù)生長期的人卵巢癌SKOV3細胞接種于96孔板培養(yǎng)24小時，設對照組及不同濃度人參皂苷Rg1(天津天士力制藥公司)組(0、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640μg/mL)，每組設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)至24h、48h和72h時分別進行噻唑藍[3-(4,5)-dimethylthiahiazo,(z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT]法檢測。每孔加入5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)3～4h，加入150μL二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide， DMSO)溶液，震蕩15min使紫色結晶充分溶解。多功能酶標儀檢測各孔570nm的吸光值。實驗重復3次。細胞增殖率(%)=(實驗組 OD 值/對照組OD 值)×100%。以藥物濃度為橫坐標，細胞增殖率為縱坐標采用GraphPad軟件繪制曲線圖。

1.3蛋白免疫印跡法

卵巢癌細胞SKOV3接種于6孔板中，24h貼壁后各組進行缺氧和/或加藥處理，48h后提取蛋白。棄去培養(yǎng)液，預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline， PBS)清洗貼壁細胞3次后加入RIPA (radio-immunoprecipitation assay)裂解液，置于冰上裂解30min，輕晃使其充分裂解，12 000rpm離心30min，收集上清即為細胞總蛋白。采用二喹啉甲酸 (bicinchoni-nic acid，BCA)比色法試劑盒測定細胞總蛋白質的濃度。在蛋白樣品中加入聚丙烯酰氨凝膠電泳上樣緩沖液，沸煮5min使其充分變性。蛋白上樣，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE)，濕轉法將樣品轉至硝酸纖維素濾膜上，于5%的脫脂奶粉TBST緩沖液室溫下脫色搖床上封閉1h。加入1:500兔抗人E-cadherin多克隆抗體(南京Bioworld公司)(或1:1 000兔抗人vimentin單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，或1:500小鼠抗人β-actin多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，或1:500兔抗人NF-κB多克隆抗體(美國Cayman Chemical公司))，4 ℃孵育過夜；加入1:2 000辣根過氧化酶標記的山羊抗兔抗體(美國Pierce公司)或1:2 000辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠抗體(美國Pierce公司)，室溫孵育1h。電化學發(fā)光法(electro-chemi-luminescence， ECL)顯影。

1.4統(tǒng)計學方法

2結果

2.1不同濃度的人參皂苷Rg1對SKOV3細胞生長的影響

用不同濃度的人參皂苷Rg1處理SKOV3細胞24h、48h和96h，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24h時，Rg1濃度超過40μg/mL時對細胞生長稍有抑制，培養(yǎng)48h時細胞生長無明顯變化，而培養(yǎng)72h時細胞生長稍有增強，見圖1。因此，選擇40μg/mL人參皂苷Rg1，培養(yǎng)24h、48h進行后續(xù)試驗。

圖1 不同濃度人參皂苷Rg1對卵巢癌SKOV3細胞生長的影響

Fig.1 The proliferation of ovarian cancer cell SKOV3 at different concentration of GRg1

2.2 缺氧條件下人參皂苷Rg1對卵巢癌細胞SKOV3形態(tài)的影響

經(jīng)過前期實驗，已成功通過三氣培養(yǎng)箱構建缺氧誘導EMT模型[16]。如圖2所示，常氧狀態(tài)下，SKOV3細胞呈現(xiàn)多角形或卵圓形，連接緊密，缺氧48h后，SKOV3細胞排列松散，細胞極性消失，呈紡錘形成纖維細胞形態(tài)，有的細胞出現(xiàn)絲狀偽足，呈現(xiàn)典型的上皮間質轉化形態(tài)。加入人參皂苷Rg1后，SKOV3細胞的EMT形態(tài)變化被部分逆轉，松散的細胞排列逐漸靠攏，梭狀細胞恢復為多角形鋪路石樣形態(tài)。

注：A 為常氧狀態(tài)下SKOV3細胞形態(tài)(control); B為缺氧(Hypoxia)48h SKOV3細胞形態(tài)(Ho48h);C為Rg1 +缺氧48h SKOV3 細胞形態(tài)(Ho48h+Rg1)。

圖2 缺氧條件下人參皂苷Rg1對卵巢癌細胞SKOV3形態(tài)的影響(×200)

Fig. 2 The morphology change of ovarian cancer cell SKOV3 under hypoxia after treatment with GRg1(×200)

2.3 缺氧條件下人參皂苷Rg1對卵巢癌SKOV3細胞EMT相關標志物表達的影響

缺氧48h后，SKOV3細胞上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達消失，間質細胞標志物vimentin蛋白表達增強，說明缺氧后，卵巢癌SKOV3細胞發(fā)生了EMT。加入40μg/mL的人參皂苷Rg1培養(yǎng)48h后，上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達恢復，而間質細胞標志物vimentin蛋白的增強表達被抑制，說明Rg1可抑制SKOV3細胞經(jīng)缺氧誘導后的EMT現(xiàn)象，見圖3。

注：*P<0.05 ,**P<0.01。

圖3 人參皂苷Rg1阻斷缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞EMT相關標志物表達

Fig. 3 The expression of EMT markers in SKOV3 under hypoxia after treatment with GRg1

2.4人參皂苷Rg1可能通過NF-κB阻斷缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞EMT

如圖4所示，缺氧誘導48h后，NF-κB蛋白表達增強，而經(jīng)人參皂苷Rg1處理后，NF-κB的表達被抑制。NF-κB的表達變化與上皮細胞標志物E-cadherin的表達呈現(xiàn)相反的趨勢。

注：*P<0.05**P<0.01)

圖4 人參皂苷Rg1可能通過NF-κB阻斷缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞EMT

Fig.4 GRg1 may inhibit hyoxia induced EMT in ovarian cancer cell SKOV3 through NF-κB

3討論

3.1人參皂苷Rg1可在體外阻斷缺氧誘導人卵巢癌SKOV3細胞的EMT

阻斷卵巢癌細胞EMT已成為治療卵巢癌的一種新思路。有研究發(fā)現(xiàn)：1α,25(OH)2D3可通過降低轉錄因子slug、snail和β-catenin的表達，阻斷卵巢癌SKOV3細胞的EMT過程，抑制卵巢癌細胞的侵襲和轉移[17]。大黃素可通過調控GSK-3β/β-catenin/ZEB1信號通路抑制卵巢癌SKOV3細胞的EMT，從而抑制細胞的侵襲[18]。舒尼替尼可通過下調TGF-β介導的EMT過程抑制卵巢癌SKOV3細胞的侵襲和轉移[19]。體外誘導EMT現(xiàn)象的方法有很多，在我們的前期研究中，通過比較4種缺氧模型，發(fā)現(xiàn)三氣培養(yǎng)箱可明顯誘導細胞發(fā)生EMT，并且可人為調控氧氣濃度、培養(yǎng)濕度和溫度，缺氧環(huán)境穩(wěn)定而持久[16]。因此本研究采用三氣培養(yǎng)箱作為卵巢癌細胞缺氧EMT的誘導條件。缺氧誘導后，人卵巢癌SKOV3細胞從上皮細胞形態(tài)轉化為間質細胞形態(tài)，上皮標志物E-cadherin表達消失，間質標志物vimentin表達增強，提示EMT誘導成功。經(jīng)過人參皂苷Rg1處理后，SKOV3細胞缺氧誘導后的變化發(fā)生了逆轉，細胞形態(tài)部分恢復為上皮細胞形態(tài)，上皮標志物表達恢復，間質標志物表達減弱。說明人參皂苷Rg1可以阻斷缺氧誘導人卵巢癌SKOV3細胞的EMT，提示其可能成為卵巢癌轉移治療中的候選藥物。

3.2人參皂苷Rg1可能通過調控NF-κB表達阻斷缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞EMT

NF-κB以二聚體的形式參與細胞生長、炎癥反應、EMT等多種生物進程，其家族成員包括RelA/p65、NFkB1/p50、NFkB2/p52、c-Rel和RelB。靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體在細胞質中與抑制蛋白IKB結合形成復合物，阻止NF-κB進入細胞核，抑制靶基因的轉錄激活。而在某些刺激因子作用下，IKB蛋白磷酸化，IKB復合物發(fā)生泛素化并被降解，游離的NF-κB進入細胞核，與DNA結合，轉錄調控下游靶基因的表達。NF-κB參與E-cadherin, MMP2，snail家族等多種基因的調控，可與Twist蛋白基因啟動子調節(jié)序列結合并上調ZEB1基因，從而抑制E-cadherin 的表達，誘導EMT 發(fā)生[20]。有報道，MED28可通過NF-κB通路調控乳腺癌細胞MCF7經(jīng)阿霉素誘導的EMT[21]。敲除根蛋白的胃癌SGC-7901細胞通過調控NF-κB /Snail通路，E-cadherin表達增強，細胞遷移能力下降[22]。Nomura 等[23]發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB通路不僅可降低胰腺癌細胞EMT基因的表達，而且可抑制淋巴血管及神經(jīng)的浸潤。我們也檢測了缺氧誘導EMT中NF-κB的變化，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞EMT，與E-cadherin表達趨勢相反，NF-κB表達升高，而經(jīng)人參皂苷Rg1處理后，其表達明顯降低。提示人參皂苷Rg1可能是通過調控NF-κB表達抑制人卵巢癌SKOV3細胞EMT，從而發(fā)揮抗腫瘤侵襲的作用。

實驗結果顯示，中藥單體人參皂苷Rg1可在體外發(fā)揮阻斷卵巢癌EMT的作用。人參皂苷Rg1對卵巢癌細胞的生長沒有顯著影響，可阻斷缺氧誘導卵巢癌SKOV3細胞的EMT，這一過程可能是通過調控NF-κB通路實現(xiàn)的。這一結果，提示人參皂苷Rg1不僅具有抗腫瘤侵襲轉移的潛能，而且對細胞的毒副作用小，有可能成為新一代抗腫瘤藥物。

[1]Kipps E,Tan D S,Kaye S B.Meeting the challenge of ascites in ovarian cancer: new avenues for therapy and research[J].Nat Rev Cancer,2013,13(4):273-282.

[2]Gardi N L,Deshpande T U,Kamble S C,etal.Discrete molecular classes of ovarian cancer suggestive of unique mechanisms of transformation and metastases[J].Clin Cancer Res,2014,20(1):87-99.

[3]Amankwah E K,Tyrer J,Lin H Y,etal.Epithelial-mesenchymal transition (EMT) gene variants influence epithelial ovarian cancer risk in women of European, African and Asian ancestry[J].Cancer,2013,73(8 Suppl):1352.

[4]Cui B,Zhang S P,Chen L G,etal.Targeting ROR1 inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis[J].Cancer Research,2013,73(12):3649-3660.

[5]Yuan H,Kajiyama H,Ito S,etal.ALX1 induces snail expression to promote epithelial-to-mesenchymal transition and invasion of ovarian cancer cells[J].Cancer res,2013,73(5):1581-1590.

[6]Huang Y T,Zhao M,Xu H X,etal.RASAL2 down-regulation in ovarian cancer promotes epithelial-mesenchymal transition and metastasis[J].Oncotarget,2014,5(16):6734-6745.

[7]Shuang T,Wang M,Zhou Y,etal.Over-expression of nuclear NF-κB1 and c-Rel correlates with chemoresistance and prognosis of serous epithelial ovarian cancer[J].Exp Mol Pathol,2016,100(1):139-144.

[8]Min C,Eddy S F,Sherr D H,etal.NF-kappaB and epithelial to mesenchymal transition of cancer[J].J Cell Biochem,2008,104(3):733-744.

[9]Hwang J W,Oh J H,Yoo H S,etal.Mountain ginseng extract exhibits anti-lung cancer activity by inhibiting the nuclear translocation of NF-κB[J].Am J Chin Med,2012,40(1):187-202.

[10]Sun Z G,Chen L P,Wang F W,etal.Protective effects of ginsenoside Rg1 against hydrogen peroxide-induced injury in human neuroblastoma cells[J].Neural Regen Res,2016 ,11(7):1159-1164.

[11]Zu G,Guo J,Che N,etal.Protective effects of ginsenoside Rg1 on intestinal ischemia/reperfusion injury-induced oxidative stress and apoptosis via activation of the Wnt/β-catenin pathway[J].Sci Rep,2016,6:38480.

[12]Tang F,Lu M,Yu L,etal.Inhibition of TNF-α-mediated NF-κB activation by Ginsenoside Rg1 contributes the attenuation of cardiac hypertrophy induced by abdominal aorta coarctation[J].J Cardiovasc Pharmacol,2016,68(4):257-264.

[13]Li J,Liu D,Wu J,etal.Ginsenoside Rg1 attenuates ultraviolet B-induced glucocortisides resistance in keratinocytes via Nrf2/HDAC2 signalling[J].Sci Rep,2016,6:39336.

[14]Yu M,Yu X,Guo D,etal.Ginsenoside Rg1 attenuates invasion and migration by inhibiting transforming growth factor-β1-induced epithelial to mesenchymal transition in HepG2 cells[J].Mol Med Rep,2015,11(4):3167-3173.

[15]Li L,Wang Y,Qi B,etal.Suppression of PMA-induced tumor cell invasion and migration by ginsenoside Rg1 via the inhibition of NF-κB-dependent MMP-9 expression[J].Oncol Rep,2014,32(5):1779-1786.

[16]劉婷,劉丹,陳葳,等.4種卵巢癌細胞缺氧模型的比較[J].中國婦幼健康研究,2013,24(4):511-513.

[17]Hou Y F,Gao S H,Wang P,etal.1α,25(OH)2D3 suppresses the migration of ovarian cancer SKOV-3 cells through the inhibition of epithelial-mesenchymal transition[J].Int J Mol Sci,2016,17(8):E1285.

[18]Hu C,Dong T,Li R,etal.Emodin inhibits epithelial to mesenchymal transition in epithelial ovarian cancer cells by regulation of GSK-3β/β-catenin/ZEB1 signaling pathway[J].Oncol Rep,2016,35(4):2027-2034.

[19]陳子博,常琳琳,周恬伊,等.舒尼替尼通過調控轉化生長因子β介導的上皮-間質轉化抑制卵巢癌細胞轉移[J].浙江大學學報(醫(yī)學版),2015,44(5):479-485.

[20]Yakubov B,Chelladurai B,Schmitt J,etal.Extracellular tissue transglutaminase activates noncanonical NF-κB signaling and promotes metastasis in ovarian cancer[J].Neoplasia,2013,15(6):609-619.

[21]Huang C Y,Hsieh N T,Li C I,etal.MED28 regulates epithelial-mesenchymal transition through NFκB in human breast cancer cells[J].J Cell Physiol,2017,232(6):1337-1345.

[22]Zhu Y W,Yan J K,Li J J,etal.Knockdown of radixin suppresses gastric cancer metastasis in vitro by up-regulation of E-cadherin via NF-κB /snail pathway[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(6):2509-2521.

[23]Nomura A,Majumder K,Giri B,etal.Inhibition of NF-kappa B pathway leads to deregulation of epithelial-mesenchymal transition and neural invasion in pancreatic cancer[J].Lab Invest,2016,96(12):1268-1278.

[專業(yè)責任編輯： 安瑞芳]

Ginsenoside Rg1 regulating NF-kappaB to block hypoxia for inducing EMT in ovarian cancer cell SKOV3

LIU Dan1, LIU Ting1, ZHAO Le2, LI Xu2

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics; 2.CenterforTranslationalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of ginsenoside Rg1 on epithelial mesenchymal transition (EMT) in ovarian cancer cell SKOV3. Methods Hypoxia model was set up to induce EMT in ovarian cancer cell SKOV3 and determine the effects of ginsenoside Rg1 on proliferation of SKOV3 cells. Cell morphology changes were observed and the expressions of E-cadherin, vimentin and NF-kappaB were measured. Results SKOV3 cells were treated with ginsenoside Rg1 at different concentration. The proliferation of SKOV3 was a little depressed when the concentration reached more than 40μg/mL at 24h, but the proliferation was not affected at 48h and 72h. After hypoxia induction for 48h, the morphology of SKOV3 cell presented as spindel-like and loosing type, the expression of E-cadherin diminished but the mesenchymal marker vimentin elevated. Treatment with 40μg/mL ginsenoside Rg1 for 48h, the EMT morphology change induced by hypoxia was partially reversed. The expression of E-cadherin recovered and expression of vimentin attenuated. At the same time, the expression of NF-κB showed a contrary change with E-cadherin. Conclusion Ginsenoside Rg1 may inhibit EMT induced by hypoxia in ovarian cancer SKOV3 cells by regulating NF-κB pathway.

ginsenoside Rg1; epithelial to mesenchymal transition; E-cadherin; vimentin; NF-κB

2017-02-13

劉 丹(1982-)，女，主治醫(yī)師，博士在讀，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

李 旭，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.03.017

R737.31

A

1673-5293(2017)03-0273-03