甲狀腺激素受體基因與卵巢癌順鉑耐藥關(guān)系的研究*

李君，劉恩令

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000）

甲狀腺激素受體基因與卵巢癌順鉑耐藥關(guān)系的研究*

李君，劉恩令

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000）

目的 探討甲狀腺激素受體基因（THRB）是否為耐藥相關(guān)基因或影響卵巢癌細(xì)胞耐藥。方法合成特異性基因探針，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)顯示細(xì)胞在激素作用下的基因表達(dá)差異。結(jié)果THRB的表達(dá)在人卵巢癌耐順鉑SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量高于非耐藥卵巢癌SKOV3細(xì)胞。結(jié)論甲狀腺激素能促進(jìn)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞和人卵巢癌SKOV3/DDP耐順鉑細(xì)胞的增殖，THRB在卵巢癌耐藥SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)的量遠(yuǎn)高于一般卵巢癌SKOV3細(xì)胞，THRB對(duì)卵巢癌耐藥起著非常重要的作用，可能是耐藥相關(guān)基因，其機(jī)制有必要進(jìn)一步探討。

甲狀腺激素受體；卵巢癌；順鉑耐藥

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第3位，而死亡率居第1位。導(dǎo)致卵巢癌5年生存率不高的一個(gè)主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物發(fā)生耐藥性[1]。卵巢癌化療耐藥不光是當(dāng)前研究的熱門，亦是卵巢癌治療走出瓶頸的關(guān)鍵。激素是人體組織細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞中，激素對(duì)其分裂、成形、遷移及凋亡均有重要調(diào)節(jié)作用，尤其在惡性腫瘤細(xì)胞中激素及激素受體基因的表達(dá)常常處于非正常狀態(tài)。為探討相關(guān)激素在卵巢癌細(xì)胞中是否與鉑類耐藥相關(guān)，本研究選擇了甲狀腺激素受體基因（thyroid hormone receptor，THRB）作為研究對(duì)象，分析其在卵巢癌耐藥細(xì)胞株（SKOV-3/DDP）的表達(dá)及功能，探討其與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和人卵巢癌耐順鉑細(xì)胞SKOV-3/DDP購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞室。培養(yǎng)條件：溫度：37℃；氣相：5%二氧化碳CO2；空氣，95%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；McCOY's 5A（100 u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素）90%。

1.2 激素作用

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含10%FBS的McCOY's 5A培養(yǎng)基（100 u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素）調(diào)整濃度為1.5×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200μl（即每孔細(xì)胞數(shù)約為3×104個(gè)），于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2，棄上清。SKOV3激素協(xié)同處理組分別加入甲狀腺素，激素含量為lμg/ml的無血清培養(yǎng)液；SKOV3/DDP激素協(xié)同處理組分別加入甲狀腺素，激素含量為lμg/ml的無血清培養(yǎng)液；對(duì)照組為不含激素的無血清培養(yǎng)液；空白組為不含細(xì)胞無血清培養(yǎng)液，每孔均為200μl。每組10個(gè)重復(fù)孔,37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h，倒置顯微鏡下觀察。

1.3 特異性探針制備

根據(jù)NCBI收錄的基因序列，制備THRB激素類基因的特異性生物素標(biāo)記基因探針。運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，正向引物：CTGAGTTGAAGGA AATGC；反向引物：AGGAGCTTGAGGATCTAA。使得擴(kuò)增產(chǎn)物在500～800 bp，另外再設(shè)計(jì)特異性探針：FAM-AAGCGTCCTCCAGCCATCA-BHQ1。使得探針能夠與擴(kuò)增產(chǎn)物匹配，同時(shí)使用生物信息學(xué)軟件對(duì)引物及探針進(jìn)行同源性檢驗(yàn)，排除假陽性擴(kuò)增以及熒光。

1.4 細(xì)胞總RNA的提取

Trizoi法按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。

1.5 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針（TaqMan探針），先用隨機(jī)引物RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase，qRT-PCR）。TaqMan探針是寡核苷酸探針，其被設(shè)計(jì)成靶向正反向引物配對(duì)的引物序列。熒光探針連接5'末端和3'末端的猝滅劑。完全匹配的探針與靶序列熒光團(tuán)所發(fā)出的熒光3'末端和猝滅劑被接近淬滅，但延長(zhǎng)反應(yīng)過程中，qTaq DNA聚合酶的5'探針殺滅核酸外切酶的活性，使熒光團(tuán)和淬滅劑分離，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度不斷增加，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，釋放的熒光團(tuán)不斷積累，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)目成正比。

1.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活力

SKOV3/DDP及SKOV3均在1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，待懸浮生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×103個(gè)/ml混勻后加進(jìn)96孔板中，每孔100μl，每組共計(jì)10孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組分別加入含有濃度為10、100和1 000 ng/ml的甲狀腺素和2.5μg/ml的順鉑無血清培養(yǎng)液；對(duì)照組為不含激素的無血清培養(yǎng)液，在第24、48和72 h，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值，計(jì)算增殖抑制率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用t檢驗(yàn)檢測(cè)用藥組與對(duì)照組之間mRNA表達(dá)差異及甲狀腺激素作用前后細(xì)胞的增殖情況。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THRB作用下SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞形態(tài)比較

倒置顯微鏡下觀察：SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，SKOV3細(xì)胞多呈圓形，上皮細(xì)胞樣，有少量長(zhǎng)棍形、多邊形，能看見細(xì)胞核，邊界清楚，折光性好。SKOV3/DDP細(xì)胞較SKOV3細(xì)胞大呈多角形，神經(jīng)元細(xì)胞樣，體積膨脹，核仁多，細(xì)胞質(zhì)可見顆粒狀囊泡，邊界模糊，折光性差。

SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所用時(shí)間為4 d，SKOV3/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所用時(shí)間為6 d。甲狀腺激素協(xié)同作用對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)均有明顯促進(jìn)作用，倒置顯微鏡下觀察：2種細(xì)胞均在作用48 h后到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。激素處理的細(xì)胞液出現(xiàn)了不同程度的變化，卵巢癌耐順鉑細(xì)胞的培養(yǎng)液顏色變淺速度加快，原來3 d換液1次，激素處理后達(dá)到2 d換液1次，卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液換液時(shí)間也比對(duì)照組提前，但與卵巢癌細(xì)胞相當(dāng)。見圖1。

2.2 設(shè)計(jì)的基因探針及引物

根據(jù) Gen Bank數(shù)據(jù)庫THRB（批準(zhǔn)號(hào)：NM001252634）和內(nèi)參照基因β-actin（ACTB批準(zhǔn)號(hào)：NM001101)，應(yīng)用Primer Express 5.0設(shè)計(jì)各基因正反向引物和探針，并應(yīng)用BLAST引擎對(duì)設(shè)計(jì)的每條引物進(jìn)行特異性分析，確?；驇烊祟愐阎钠渌蚺c每條引物比對(duì)無高度同源性。根據(jù)濾波器的波長(zhǎng)定量PCR儀，TaqMan熒光探針熒光作為熒光報(bào)告基因，BHQ1為猝滅基因。引物和探針均由上海生物工程股份有限公司合成。

2.3 THRB在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞與耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR反應(yīng)液采用大連寶生物工程股份有限公司的Premix Ex Taq試劑盒，引物和探針由上海生物工程股份有限公司合成。循環(huán)參數(shù)：95℃1min，1個(gè)循環(huán)；95℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)后檢測(cè)熒光。結(jié)果如下圖所示，THRB激素受體基因在耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞及其人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中均有表達(dá)。為了明確THRB在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞及其耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞中表達(dá)有無差異，本實(shí)驗(yàn)提取了激素干預(yù)后人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞及其耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行THRB在人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞與耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞的定量分析。定量分析結(jié)果見表1及圖2、3：在甲狀腺激素作用下，THRB表達(dá)水平均有提高，在耐順鉑SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平高于其親本細(xì)胞人卵巢癌SKOV3細(xì)胞。（t=2.2553，P=0.0436）。

2.4 甲狀腺激素作用前后SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖情況

甲狀腺素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及耐順鉑SKOV3/ DDP細(xì)胞的體外生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，隨著激素濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用增加。SKOV3細(xì)胞在不同濃度激素作用24、48和72 h作用后，其細(xì)胞增殖情況采用重復(fù)測(cè)量方差進(jìn)行分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖情況有差別（F=252.935，P=0.000）；②不同濃度激素作用后細(xì)胞的增殖情況有差別（F=39.372，P=0.000），激素濃度越大，細(xì)胞增殖作用越明顯；③不同濃度激素作用下的細(xì)胞增殖趨勢(shì)有差別（F=28.846，P=0.000）。SKOV3/DDP細(xì)胞在不同濃度激素作用24、48和72 h后細(xì)胞增殖情況采用重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖情況有差別（F=607.076，P=0.000）；②不同濃度激素作用后細(xì)胞的增殖情況有差別（F=57.965，P=0.000），激素濃度越大，細(xì)胞增殖作用越明顯；③不同濃度激素作用下的細(xì)胞增殖趨勢(shì)有差別（F=61.248，P=0.000）。見表2、圖4。

表1 THRB相對(duì)初始拷貝數(shù) （n=3，±s）

表1 THRB相對(duì)初始拷貝數(shù) （n=3，±s）

組別THRB表達(dá)水平無激素作用48 h SKOV3 0.0449±0.0115無激素作用48 h SKOV3/DDP 0.0497±0.0108 1 000 ng/m l激素作用48 h SKOV3 0.0515±0.0127 1 000 ng/m l激素作用48 h SKOV3/DDP 0.0938±0.0299

圖1 THRB作用下SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的形態(tài)比較

圖2 內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 THRB的擴(kuò)增曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 不同濃度激素作用不同時(shí)間后各組細(xì)胞的吸光度值比較

圖4 激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

3 討論

卵巢癌起病隱匿，75%的患者確診時(shí)已為晚期并伴有廣泛轉(zhuǎn)移,手術(shù)常不能完全切除，故目前最常用的治療方案為腫瘤減滅術(shù)+以鉑類為基礎(chǔ)的藥物聯(lián)合化療[2]；雖然80%患者對(duì)以鉑類為基礎(chǔ)的一線化療方案敏感[3]，但3年內(nèi)復(fù)發(fā)率卻高達(dá)60%～70%以上；其中大部分患者在一線化療后出現(xiàn)繼發(fā)性鉑類耐藥,最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)[4]。而鉑類耐藥最近研究較多，MARIYA等[5]研究表明，免疫逃逸可能是卵巢癌鉑類耐藥的機(jī)制之一。而大量研究證明，卵巢癌是一種激素依賴性腫瘤，一旦人體多種激素分泌失調(diào)會(huì)導(dǎo)致人體對(duì)細(xì)胞的正常調(diào)控作用出現(xiàn)失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞自主增殖或凋亡減少，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢癌產(chǎn)生耐藥。甲狀腺激素對(duì)鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞的影響較少，國(guó)外研究表明[6]，卵巢癌上皮組織中TSHRmRNA表達(dá)降低而蛋白表達(dá)升高,此項(xiàng)驗(yàn)研究證明卵巢癌患者甲狀腺刺激素受體蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)異常。順鉑是治療卵巢癌的主要化療藥物，正是因?yàn)轫樸K的出現(xiàn)使卵巢癌治療出現(xiàn)了重大轉(zhuǎn)機(jī)，使卵巢癌5年生存率有了較大改觀。而一些患者在治療一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生耐藥，這導(dǎo)致治療失敗，影響了預(yù)后。因此為進(jìn)一步探討順鉑耐藥的機(jī)制，從而為克服耐藥提供理論依據(jù)，縱多學(xué)者從多方面進(jìn)行的深入研究，本研究從激素角度探討卵巢癌鉑類耐藥機(jī)制，結(jié)果表明，THRB的表達(dá)在人卵巢癌耐順鉑SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量高于卵巢癌SKOV3細(xì)胞。因此認(rèn)為甲狀腺激素能促進(jìn)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞和人卵巢癌SKOV3/DDP耐順鉑細(xì)胞的增殖，THRB在卵巢癌耐藥SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量也高于一般卵巢癌SKOV3細(xì)胞，THRB對(duì)卵巢癌耐藥起著非常重要的作用，可能是耐藥相關(guān)基因。

卵巢癌鉑類耐藥機(jī)制復(fù)雜而多樣，涉及多藥耐藥基因及多種激素類基因。本研究為探討激素類基因在卵巢癌鉑類耐藥中的作用進(jìn)行了初步研究，為將來進(jìn)一步探討更深層次的機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]BALCH C,HUANG TH,BROWN R,et al.The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization[J].American Journal of Obstetrics and Gynecology,2004,191(5):1552-1572.

[2]MARCUS C S,MAXWELL G L,DARCY K M,et al.Current approaches and challenges in managing and monitoring treatment response in ovarian cancer[J].J Cancer,2014(5):25.

[3]KELLAND L.The resurgenceof platinum-based cancer chemotherapy[J].Nature Reviews Cancer,2007,7(8):573-584.

[4]SORRENTINO A,LIU C G,ADDARIO A,et al.Role of microRNAs in drug-resistant ovarian cancer cells[J].Gynecologic oncology,2008,111(3):478-486.

[5]MARIYA T,HIROHASHI Y,TORIGOE T,et al.Prognostic impact of human leukocyte antigen class I expression and association of platinum resistance with immunologic profiles in epithelial ovarian cancer[J].Cancer Immunol Res 2014,2(12):1220-1229.

[6]SCARFONE G,BERGAMINI A,NOLI S,et al.Characteristics of clear cell ovarian cancer arising from endometriosis:A two center cohort study[J].Gynecol Oncol,2014,133(3):480-484.

（張西倩 編輯）

Relationship betweenTHRBand cisp latin resistance in ovarian cancer cells*

Jun Li,En-ling Liu
(Department of Gynecology and Obstetrics,Tangshan Gongren Hospital Affiliated to HebeiMedical University,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo investigate whether thyroid hormone receptor gene(THRB)is a drug resistance related gene in ovarian cancer cells.MethodsThe specific gene probe was synthesized.RT-PCR technique was used to display the difference of gene expression under the action of thyroid hormone.ResultsThe expression ofTHRBin the human ovarian cancer SKOV3/DDP cells was significantly higher than that in the non-resistant ovarian cancer SKOV3 cells.ConclusionsThyroid hormone can promote the proliferation of human ovarian cancer SKOV3 and SKOV3/DDP cells.The expression ofTHRBin the ovarian cancer SKOV3/DDP cells ismuch higher than that in the non-resistant ovarian cancer SKOV3 cells.THRBmay play a very important role in drug-resistance of ovarian cancer and may be a drug resistance related gene,and itsmechanism is necessary to be further explored.

thyroid hormone receptor,ovarian cancer;platinum resistance

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.008

1005-8982（2017）07-0036-05

2016-11-27

河北省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)科技研究計(jì)劃（No：1020140385）

劉恩令，E-mail：enling111@sina.com；Tel：13832828669