基于特征圖譜的黃芩黃酮類(lèi)成分固相萃取研究

郭威，王亮，周倩， 聶穎蘭， 崔寧 ，于宗淵*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南250014；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 北京 100700)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

基于特征圖譜的黃芩黃酮類(lèi)成分固相萃取研究

郭威1,2，王亮1,2，周倩1,2， 聶穎蘭3， 崔寧2，于宗淵2*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南250014；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 北京 100700)

采用HPLC法建立黃芩中黃酮類(lèi)成分的特征圖譜，以6個(gè)主要特征峰的回收率和特征圖譜相似度為指標(biāo)，優(yōu)選固相萃取小柱填料、淋洗液和洗脫條件。最終確定C18固相萃取小柱對(duì)6個(gè)成分的回收率最高，淋洗液為甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)，洗脫液為甲醇(含0.3%甲酸)，純化后6個(gè)主要特征峰的回收率均在89%以上，HPLC特征圖譜相似度大于0.98。采用HPLC特征圖譜指導(dǎo)優(yōu)化黃芩黃酮類(lèi)成分的固相萃取純化方法，可保持純化前后黃芩有效組分中化學(xué)成分的一致性。

黃芩；HPLC特征圖譜；固相萃??；黃酮類(lèi)成分

由于中藥具有成分復(fù)雜多樣且極性差異較大的特點(diǎn)，因此其有效組分的分離純化一直是中藥樣品前處理過(guò)程中亟待解決的重要問(wèn)題。固相萃取作為一種試樣預(yù)處理技術(shù)，能有效地將分析物與干擾組分分離，具有高選擇性、高回收率、低溶劑消耗、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)[1-2]，近年來(lái)將其應(yīng)用于中藥有效組分的富集和純化中的研究日益增多。但在純化條件的研究中，多以一種或幾種有效成分的含量為考察指標(biāo)，不符合中藥多成分的特點(diǎn)。特征圖譜作為一種綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的手段，將其作為指標(biāo)優(yōu)化純化條件，能夠準(zhǔn)確地保證有效組分分離前后的一致性。

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效[3]。主要有效成分為黃酮類(lèi)化合物，還含有少量油脂類(lèi)、蠟質(zhì)等弱極性物質(zhì)以及氨基酸、糖等強(qiáng)極性物質(zhì)，其理化性質(zhì)有較大差異。本文采用固相萃取小柱來(lái)分離純化黃芩中的黃酮類(lèi)成分，除去弱極性及強(qiáng)極性的干擾物質(zhì)，快速分離和富集目標(biāo)成分，提高分析檢測(cè)時(shí)的靈敏度，降低樣品對(duì)分析柱的污染，并以特征圖譜作為固相萃取分離純化黃芩中黃酮類(lèi)有效組分的評(píng)價(jià)手段，以特征圖譜的相似度和幾種主要有效成分的回收率為指標(biāo)，綜合探討純化條件，保證黃酮類(lèi)成分的最大保留。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200系列高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫公司)；6320離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)，配備電噴霧離子源；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)；BP211D型電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；Simplicity純水儀(美國(guó)密理博公司)；KDM型控溫電熱套(鄄城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 試藥

AccuBondII SPE ODS-C18Cartridges固相萃取柱(美國(guó)安捷倫公司，產(chǎn)品編號(hào)188-1320)；Cleanert PA 聚酰胺固相萃取小柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)；高效液相色譜用甲醇為色譜純，水為超純水，甲酸等其他試劑均為分析純。

黃芩為市售中藥飲片，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究室林慧彬研究員鑒定，均為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩提取液的制備

稱(chēng)取黃芩粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.3 g，置具塞錐形瓶中，加60 mL水，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液1。

2.2 黃芩HPLC特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.3%磷酸(B)，梯度洗脫(0～30 min，85%～75%B；30～45 min，75%～70%B；45～50 min，70%～60%B；50～55 min，60%B；55～60 min，60%～40%B；60～65 min，40%～30%B；65～75min，30%～0%B)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩提取液的HPLC特征圖譜Fig.1 HPLC characteristic chromatogram of Radix Scutellariae extract

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批黃芩提取液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄特征圖譜，6次測(cè)定圖譜10個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批黃芩按2. 1項(xiàng)下方法制備6份樣品，分別測(cè)定，6份樣品的10個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取新制備的黃芩提取液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定圖譜的10個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.07%～0.58%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.54%～2.91%，表明該方法處理的黃芩提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 黃芩HPLC特征圖譜中特征峰的結(jié)構(gòu)解析

根據(jù)DAD在線(xiàn)紫外光譜信息，初步判斷1～10號(hào)峰為黃酮類(lèi)化合物，結(jié)合文獻(xiàn)，通過(guò)HPLC-MSn質(zhì)譜信息對(duì)黃芩特征峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩HPLC特征圖譜中特征峰的質(zhì)譜解析

1號(hào)峰和2號(hào)峰的分子量相同，為同分異構(gòu)體，推斷可能為白楊素-葡萄糖-阿拉伯糖苷，且1、2號(hào)峰二級(jí)質(zhì)譜碎片相同但碎片豐度不同，見(jiàn)圖2。推測(cè)是由于阿拉伯糖存在呋喃型和吡喃型兩種結(jié)構(gòu)，六元環(huán)椅式構(gòu)象比五元環(huán)折疊式穩(wěn)定。因此，在相同質(zhì)譜條件下，呋喃型阿拉伯糖基易于開(kāi)環(huán)，消耗的碰撞能量少，從而易于產(chǎn)生較大的中性丟失；吡喃型阿拉伯糖基相對(duì)穩(wěn)定，開(kāi)環(huán)消耗的能量大，較小的中性丟失較多。由于六元環(huán)氧孤對(duì)電子易被分散，原子之間的電負(fù)性小，因此極性小，而五元呋喃糖的電子分散程度及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定程度低于六元吡喃糖，各原子之間的電負(fù)性較大，所以呋喃糖極性大于吡喃糖，在反相柱中先流出。故推斷1號(hào)峰為白楊素-葡萄糖-呋喃阿拉伯糖苷，2號(hào)為白楊素-葡萄糖-吡喃阿拉伯糖苷。

A 1號(hào)峰； B 2號(hào)峰。圖2 1號(hào)峰和2號(hào)峰的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Second-stage mass spectrum diagrams of peak 1 and peak 2

2.3 黃芩中黃酮類(lèi)成分固相萃取純化條件的優(yōu)化

2.3.1 在不同洗脫劑下固相萃取小柱填料的影響

取不同類(lèi)型的SPE小柱，分別用8 mL甲醇和8 mL水預(yù)淋洗。

精密量取按2.1項(xiàng)下方法制備的黃芩提取液1 mL，上樣，用3 mL甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)分3次淋洗SPE小柱，每次1 mL，棄去淋洗液，吹出殘留溶劑，用表2中的洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液至50 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL甲醇，振蕩溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液2。

以供試液2的HPLC圖譜中峰面積較大的6個(gè)特征成分(3，4，6，7，8，9號(hào)峰)為指標(biāo)，與未經(jīng)固相萃取處理的供試液1比較，計(jì)算各主峰的回收率[9]。

回收率(%)=(供試品溶液1主峰峰面積/供試品溶液2主峰峰面積)×100% 。

采用國(guó)家藥典委員會(huì)出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件計(jì)算各洗脫液特征圖譜與黃芩提取液指紋圖譜相似度。

表2 填料類(lèi)型對(duì)主峰回收率和特征圖譜相似度的影響

表2的結(jié)果表明，在其他工藝條件都相同的情況下，不同填料類(lèi)型的固相萃取小柱對(duì)黃芩提取液中各成分的保留率不同，當(dāng)洗脫溶劑為甲醇時(shí)，聚酰胺小柱與C18小柱相比，各主峰保留率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于C18小柱；當(dāng)洗脫溶劑為甲醇(含0.3%氨水)、甲醇(含0.3%甲酸)時(shí)，主峰保留率有所提高，但仍低于C18小柱，并且洗脫液的特征圖譜與黃芩提取液特征圖譜的相似度也均低于C18小柱，因此選擇C18小柱。

2.3.2 淋洗液種類(lèi)及洗脫液種類(lèi)的考察

取1 mL黃芩提取液，上樣，分別用水、甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)、甲醇-0.3%甲酸(40∶60，V/V)、甲醇-0.3%甲酸(60∶40，V/V)、甲醇-0.3%甲酸(80∶20，V/V)、甲醇、甲醇(含0.3%甲酸)分三次淋洗C18SPE小柱，每次1 mL，收集每個(gè)淋洗梯度的洗脫液至50 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL甲醇，振蕩溶解，按2.2.1中色譜條件測(cè)定3，4，6，7，8，9號(hào)峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 淋洗液及洗脫液種類(lèi)對(duì)主峰回收率和特征圖譜相似度的影響

水和甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)洗脫液中無(wú)特征成分出現(xiàn)，故選擇甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)為淋洗液，既可將氨基酸、糖等強(qiáng)極性物質(zhì)洗脫下來(lái)，又不影響特征成分的回收率。由表3結(jié)果可見(jiàn)，甲醇-0.3%甲酸(40∶60，V/V)洗脫液中開(kāi)始出現(xiàn)特征成分，黃芩苷、黃芩素-6-O-葡萄糖酸苷、木蝴蝶素-7-O-葡萄糖酸苷、漢黃芩苷、黃芩素主要集中在甲醇-0.3%甲酸(60∶40，V/V)和甲醇-0.3%甲酸(80∶20，V/V)洗脫液中，甲醇-0.3%甲酸(60∶40，V/V)洗脫液與原提取液的相似度最高，但洗脫不完全。漢黃芩素主要集中于甲醇-0.3%甲酸(80∶20，V/V)洗脫液中，甲醇洗脫液中基本無(wú)特征成分，但當(dāng)洗脫液換為甲醇(含0.3%甲酸)時(shí)，又可將部分特征成分洗脫下來(lái)，故確定以甲醇(含0.3%甲酸)為洗脫液。

2.3.2 洗脫液用量的考察

精密量取按2.1項(xiàng)下方法制備的黃芩提取液1 mL，上樣，用3 mL甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)分3次淋洗C18SPE小柱，每次1 mL，棄去淋洗液，吹出殘留溶劑，采用甲醇(含0.3%甲酸)洗脫，每次1 mL，共洗脫4次，收集洗脫液至50 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL甲醇，振蕩溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，按2.2.1中色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，第三次洗脫后仍有特征成分出現(xiàn)，第四次洗脫后無(wú)特征峰，即3 mL 的甲醇(含0.3%甲酸)可將吸附的黃酮類(lèi)成分基本洗脫完全，因此確定洗脫液的用量為3 mL。

A第一次洗脫; B第二次洗脫; C第三次洗脫; D第四次洗脫。圖3 不同體積甲醇洗脫液的色譜圖Fig.3 Chromatograms of methanol eluent at different volume

2.3.6 方法專(zhuān)屬性

精密吸取蒸餾水1 mL上樣，用3 mL甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)分3次淋洗SPE小柱，每次1 mL，棄去淋洗液，吹出殘留溶劑，用3 mL甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)洗脫，收集洗脫液至50 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL甲醇，振蕩溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，按2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，得空白溶液的色譜圖(見(jiàn)圖4)。由空白與黃芩提取液的色譜圖(圖1)比較可知，用本實(shí)驗(yàn)擬定固相萃取方法處理黃芩提取液后，在70 min色譜記錄時(shí)間內(nèi)無(wú)干擾成分流出。

圖4 空白溶液的色譜圖Fig.4 Chromatogram of blank solution

2.3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取黃芩粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.3 g，置具塞錐形瓶中，加60 mL 水，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，得黃芩提取液。取C18固相萃取小柱，分別用8 mL甲醇和8 mL水預(yù)淋洗SPE小柱。精密量取黃芩提取液1 mL，上樣，用3 mL甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)分3次淋洗SPE小柱，每次1 mL，棄去淋洗液，吹出殘留溶劑，用3 mL甲醇(含0.3%甲酸)洗脫，收集洗脫液至50 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL甲醇，振蕩溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，按2.2.1中色譜條件測(cè)定，計(jì)算各主峰的回收率(見(jiàn)表4)。結(jié)果表明，黃芩提取液經(jīng)固相萃取處理后黃芩苷、黃芩素-6-O-葡萄糖酸苷、木蝴蝶素-7-O-葡萄糖酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的回收率均在89%以上，重現(xiàn)性較好，說(shuō)明確定的固相萃取小柱填料類(lèi)型、淋洗液種類(lèi)、洗脫液種類(lèi)及用量等條件較為合理，重復(fù)性好且主成分保留率較高。黃芩中黃酮類(lèi)成分的HPLC特征圖譜與黃芩水提液的HPLC特征圖譜相似度均大于0.98，實(shí)現(xiàn)了成分的均衡回收[9]。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC特征圖譜，對(duì)黃芩水提液中黃酮類(lèi)成分的固相萃取條件進(jìn)行了考察，結(jié)果表明用甲醇-0.3%甲酸(20∶80，V/V)淋洗，甲醇(含0.3%甲酸)洗脫，可以特異性地獲取黃酮類(lèi)成分，6個(gè)特征成分的回收率均在89%以上。在考察固相萃取淋洗和洗脫條件中發(fā)現(xiàn)，甲醇(含0.3%甲酸)洗脫能力強(qiáng)于純甲醇，可能由于黃酮類(lèi)成分多呈酸性，加酸后可抑制其電離，控制其呈分子狀態(tài)，減少了洗脫時(shí)間，故加入甲酸后使甲醇的洗脫能力增強(qiáng)。

與固相萃取前相比，黃芩水提取物經(jīng)固相萃取后浸膏重量減少了10%，故本實(shí)驗(yàn)建立的固相萃取方法可除去多糖等雜質(zhì)，有利于減少非特征成分干擾、縮短分析時(shí)間和保護(hù)分析柱。

本實(shí)驗(yàn)以黃芩中6個(gè)特征成分(黃芩苷、黃芩素-6-O-葡萄糖酸苷、木蝴蝶素-7-O-葡萄糖酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素)的回收率和特征圖譜的相似度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，跟蹤評(píng)價(jià)固相萃取的處理效果，與傳統(tǒng)的以單一成分保留率為指標(biāo)的評(píng)價(jià)方法相比更為精細(xì)，可較全面地反映固相萃取前處理中藥樣品時(shí)其藥效物質(zhì)的回收率，更好地體現(xiàn)了中藥多成分的特征，可為中藥中目標(biāo)成分的分離與富集方法提供參考。

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Solid phase extraction of flavonoids from Radix Scutellariae based on specific chromatogram

GUO Wei1，2, WANG Liang1，2, ZHOU Qian1,2,NIE Ying-lan3,CUI Ning2,YU Zong-yuan2*

(1. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, China; 3. Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

∶The specific chromatogram of flavonoids in Radix Scutellariae was established by HPLC in this paper. The column filling, eluent and the elution condition of solid phase extraction were optimized using the recovery rates and specific spectral similarity of six main characteristic peaks in HPLC specific chromatogram as indexes. Experimental results confirmed that C18solid phase extraction (SPE) possessed the highest recovery rates of six components. The SPE column was rinsed with methanol-0.3% formic acid(20∶80，V/V), and then was eluted finally with methanol (containing 0.3% formic acid). After being purified, the recovery rates of six components were all over 89%, and the similarity of characteristic chromatogram was higher than 0.98. Based on HPLC characteristic chromatogram, the optimized purification process of flavonoids in Radix Scutellariae with solid phase extraction can ensure that the main effective components remain consistent before and after purification of Radix Scutellariae.

∶Radix Scutellariae; HPLC specific chromatogram; solid phase extraction; flavonoids

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.02.003

2016-07-27

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2015-164)

郭威(1982—)，女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幏治雠c質(zhì)量控制。E-mail：331527800@qq.com

*通信作者，于宗淵，博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幏治雠c質(zhì)量控制。E-mail：yuzys@sohu.com

R284.2

A

1002-4026(2017)02-0013-07