基于斑馬魚模型的昆海姜辛湯組分配伍的抗炎作用研究

彭維兵, 周玲曉,,3, 付先軍,何秋霞, 王振國*, 劉可春*

(1.山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)醫(yī)史文獻學泰山學者工作室，山東 濟南 250355；3.石藥集團抗腫瘤藥事業(yè)部，河北 石家莊 050035)

【藥理與毒理】

基于斑馬魚模型的昆海姜辛湯組分配伍的抗炎作用研究

彭維兵1, 周玲曉1,2,3, 付先軍2,何秋霞1, 王振國2*, 劉可春1*

(1.山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)醫(yī)史文獻學泰山學者工作室，山東 濟南 250355；3.石藥集團抗腫瘤藥事業(yè)部，河北 石家莊 050035)

為了研究海洋中藥復方昆海姜辛湯組分配伍的抗炎作用，利用硫酸銅溶液誘導建立斑馬魚炎癥模型，分別以不同濃度的昆海姜辛湯組分配伍溶液(100、50、25 μg/mL)干預此模型，在體視熒光顯微鏡下觀察其對斑馬魚巨噬細胞數(shù)量的影響。結果表明，昆海姜辛湯的合方組分配伍溶液使硫酸銅誘導的斑馬魚炎癥模型的巨噬細胞的數(shù)量明顯減少，具有抗炎作用。

昆海姜辛湯；組分配伍；斑馬魚；抗炎

海洋中藥用于防治疾病在我國已經(jīng)有幾千年的歷史，是中藥寶庫中的重要組成部分，其研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)成為國家海洋經(jīng)濟重要的增長點之一[1-3]。中藥有效組分配伍模式是以中醫(yī)藥理論為基礎，以系統(tǒng)的科學思想為指導，遵循傳統(tǒng)方劑配伍理論和原則，經(jīng)嚴謹規(guī)劃，針對有限適應病證，利用中藥中成(組)分明確、藥理作用清楚的生物活性物質，研究具有某一特定藥理作用的中藥成(組)分配伍組方[4]。研究克服了飲片配伍提取量大，化學物質繁雜，質量控制標準低、效應不強、針對性差等缺點，從長遠看，亦有利于節(jié)約中藥資源，實現(xiàn)中藥的可持續(xù)發(fā)展。

本文研究的復方昆海姜辛湯，是付先軍等[5-6]基于古代文獻中的研究成果，收集幾萬條歸肺經(jīng)的中藥及其配伍規(guī)律、化學成分、藥理作用、臨床功效等信息，應用數(shù)據(jù)挖掘技術、化學信息技術、海洋植物中藥歸經(jīng)作用預測及組方設計技術而得到的。

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御性反應，巨噬細胞的遷移與吞噬過程在炎癥反應中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病的發(fā)生與發(fā)展都與炎癥有著密切的關系，因此有效控制炎癥的發(fā)生與發(fā)展引起眾多學者的關注。

體外研究發(fā)現(xiàn)，昆海姜辛湯的多種組分具有增強免疫和抗炎活性。昆布多糖可明顯增強巨噬細胞吞噬功能，其富含的巖藻糖、甘露糖和硫酸基，可激活巨噬細胞而達到增強免疫的目的[7]。褐藻多糖硫酸酯可誘導巨噬細胞活化，分泌NO、TNF-a、IL_6 等炎性細胞因子[8]。Zhang[9]等的研究發(fā)現(xiàn)，褐藻多糖硫酸酯減少了實驗性炎癥過程中選擇素介導的白細胞浸潤和組織損傷。干姜具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、利膽、抗菌、抗病原體的作用，可能是通過抑制PG合成、對抗5-羥色胺和組胺以及促皮質激素樣作用產(chǎn)生抗炎效應。細辛揮發(fā)油可降低炎癥滲出液中組胺含量，亦可抑制對大鼠胸腔注射角叉菜膠引起的白細胞游走及大鼠棉球肉芽腫[10]。因此，本研究選取昆布多糖、褐藻多糖、姜辣素、細辛脂素作為主要組分，在中醫(yī)“君臣佐使”理論基礎的指導下進行配伍，驗證其體內抗炎活性[5]。

斑馬魚(Daniorerio)體型較小，成魚體長4～6 cm，具有繁殖力強、性成熟周期短、體外受精、胚胎透明、基因與人類基因保守度高等特點。因此，斑馬魚目前已經(jīng)成為一種研究人類疾病的模式動物。本研究利用硫酸銅特異性損傷側線毛細胞，造成炎癥病灶，建立斑馬魚炎癥模型，探討昆海姜辛湯組分配伍的體內抗炎作用。

1 實驗材料

1.1 斑馬魚品系

巨噬細胞熒光轉基因斑馬魚(zlyz:egfp)，取自山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺，其養(yǎng)殖和培育參照Westerfield所述方法[11]。選擇成熟的斑馬魚，按照雌魚與雄魚1∶1或者1∶2的比例置入繁殖缸內，次日清晨取出受精卵，加入亞甲基藍溶液，放入28 ℃培養(yǎng)箱中孵化，備用。

1.2 材料與試劑

昆布多糖購自濟南匯豐科貿(mào)有限公司(質量分數(shù)99%，批號：14092923)；褐藻多糖購自中國海洋大學(質量分數(shù)90%，批號：14072526)；姜辣素購自成都普菲德生物技術有限公司(質量分數(shù)99%，批號：140914)；細辛脂素購自成都普菲德生物技術有限公司(質量分數(shù)99%，批號：151116)；二甲基亞楓(DMSO)購自國藥集團化學試劑有限公司(批號：20150530)；硫酸銅購自北京益利精細化學品有限公司(批號：20140512)；4%多聚甲醛購自北京益利精細化學品有限公司；Tween20，TEMED，購自美國Sigma公司。

2 實驗方法

2.1 配制樣品溶液

2.1.1 昆海姜辛湯各組分溶液的配制

昆布多糖、褐藻多糖、姜辣素、細辛脂素用胚胎培養(yǎng)用水配制成1 mg/mL的儲液；對于水溶性較差的姜辣素、細辛脂素，以二甲基亞砜為溶劑配制1 mg/mL的儲液，放入4 ℃冰箱備用。

2.1.2 硫酸銅溶液的配制

硫酸銅粉末用純凈水配成10 mmol/L的儲液，工作液濃度是20 μmol/L。

2.1.3 收集胚胎

雌雄斑馬魚分開喂養(yǎng)，水溫控制在28 ℃，照明 14 h 與黑暗10 h交替進行，以人工顆粒狀餌料和剛孵出的鹵蟲無節(jié)幼體(Artemia) 定時喂養(yǎng)。取卵時，于傍晚取健康性成熟的成年雌雄斑馬魚各兩條放于底部具有篩板的交配缸內，中部用透明擋隔開，次日上午將擋板撤去，10時左右收集受精卵( 透明狀，小米大小)。收集后，移入質量分數(shù)0.5%亞甲基藍溶液中(胚胎培養(yǎng)用水配制)，清洗消毒胚胎(消毒液以170 mL 培養(yǎng)用水中加入0.1 mL 5%次氯酸鈉溶液制得)，幾分鐘后將其移入清潔的胚胎培養(yǎng)用水中，28 ℃下控光培養(yǎng)72 h 后，在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的胚胎，即獲得實驗用動物模型。

2.1.4 昆海姜辛湯與仔魚共孵育

取48孔培養(yǎng)板，每6孔為一組，取適量的樣品母液，用胚胎培養(yǎng)用水稀釋得到不同濃度的樣品溶液，二甲基亞砜的質量分數(shù)不大于0.5%。選擇受精后3 d的巨噬細胞標記熒光的轉基因斑馬魚仔魚放入48孔板，每孔2 mL培養(yǎng)水，8條仔魚，不同濃度的昆海姜辛湯提前 30 min 與斑馬魚仔魚孵育，以利于中藥成分進入斑馬魚體內。昆海姜辛湯各組分配伍(寒寒組：昆布多糖+褐藻多糖；熱熱組：姜辣素+細辛脂素；寒熱組：昆布多糖+褐藻多糖+姜辣素+細辛脂素)的濃度分別為100 、50 、25 μg/mL。然后，向各個實驗組中加入終濃度為20 μmol/L的硫酸銅溶液處理仔魚1 h,同時設定溶劑對照組。隨后加蓋封閉，放于可控溫光照培養(yǎng)箱中恒溫( 28 ℃)共同孵育。

2.1.5 結果觀測

孵育完成后，吸出培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛溶液(pH = 7.4)于室溫下固定仔魚1 h，然后用 PBS-Tween20 洗3次，每次5 min。GFP標記斑馬魚固定后一天，在熒光顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞的數(shù)量，以觀察其炎癥反應。為方便觀察巨噬細胞的數(shù)量，可將斑馬魚側躺于凹槽載玻片里，盡量吸干載玻片上的固定液。

2.1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析都采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS16.0對實驗數(shù)據(jù)進行處理，并進行樣本組間多重比較。如果p<0.05，則認為存在顯著性差異。

3 實驗結果

從圖1、圖2結果可以發(fā)現(xiàn)，空白對照組和硫酸銅組的斑馬魚，其巨噬細胞在頭部、卵黃囊、軀干部以及尾部均出現(xiàn)聚集，但硫酸銅組的巨噬細胞的數(shù)量明顯多于空白對照組，說明利用硫酸銅誘導斑馬魚炎癥模型是成功的[12-13]。

在中醫(yī)“君臣佐使”理論基礎的指導下，本研究將昆海姜辛湯各中藥質量比設定為3∶3∶2∶1，同時篩選各味中藥中所占質量分數(shù)較多、文獻報道具有抗炎活性的組分。通過文獻查詢，選取昆布多糖、褐藻多糖、姜辣素、細辛脂素作為主要組分，組分的質量比同樣設定為3∶3∶2∶1。根據(jù)昆海姜辛湯中各味藥材的藥性，在中藥藥性理論指導下進行組分配伍[5]。分為寒熱兩類，分別進行配伍，昆布多糖與褐藻多糖(質量比1∶1)為寒寒組，姜辣素與細辛脂素(質量比2∶1,)為熱熱組，昆布多糖、褐藻多糖、姜辣素和細辛脂素(質量比3∶3∶2∶1)為寒熱組。

在溶液濃度為100 μg/mL時，昆布多糖與褐藻多糖配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量明顯減少；姜辣素和細辛脂素組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量沒有明顯的減少；但是在昆布多糖、褐藻多糖、姜辣素和細辛脂素合方的組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量減少得更為明顯。

在溶液濃度為50 μg/mL時，昆布多糖與褐藻多糖組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量有所減少，但并不明顯；在姜辣素和細辛脂素組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量沒有明顯的減少；但是在昆布多糖、褐藻多糖、姜辣素和細辛脂素合方的組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量減少得比較明顯。

在溶液濃度為25 μg/mL時，昆布多糖與褐藻多糖組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量沒有明顯減少；在姜辣素和細辛脂素的組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量沒有明顯的變化；但是在昆布多糖、褐藻多糖、姜辣素和細辛脂素合方的組分配伍溶液的斑馬魚組中，其巨噬細胞的數(shù)量亦沒有明顯的減少。

以上分析說明，昆海姜辛湯不同濃度的組分配伍可以使硫酸銅誘導的斑馬魚炎癥模型的巨噬細胞的數(shù)量明顯減少，說明昆海姜辛湯合方的組分配伍具有抗炎作用。

寒寒組：昆布多糖+褐藻多糖；熱熱組：姜辣素+細辛脂素；寒熱組：昆布多糖+褐藻多糖+姜辣素+細辛脂素。圖1 昆海姜辛湯組分配伍對斑馬魚炎癥反應的影響Fig.1 The anti-inflammatory effect of component from Kunhai ginger decoction on zebrafish inflammatory model

寒寒組：昆布多糖+褐藻多糖；熱熱組：姜辣素+細辛脂素；寒熱組：昆布多糖+褐藻多糖+姜辣素+細辛脂素。與模型組相比，**P<0.01;*P<0.05。圖2 昆海姜辛湯組分對斑馬魚仔魚側線巨噬細胞數(shù)量的影響Fig.2 The effect of component from Kunhai ginger decoction on the number of macrophage on zebrafish lateral line

4 討論

目前，斑馬魚已廣泛應用于構建人類疾病模型[14]及相關藥物篩選[15-16]等方面，如抗新生血管形成、腫瘤、血液疾病、細胞凋亡和增殖、脂質代謝、炎癥和中樞耐受等[17-19]。與線蟲、果蠅、鼠等其他模式生物相比，在結構、生理、分子水平等方面，斑馬魚器官與人器官驚人地相似，在蛋白質水平上，關鍵部位的同源性幾乎是100%。熒光標記轉基因系斑馬魚胚胎透明，應用轉基因技術，通過特異性基因啟動子控制下游的綠熒光蛋白(Egfp)，在特定的器官或細胞中表達，可以實現(xiàn)對某一特定器官或細胞的示蹤。因此，本研究選用巨噬細胞標記熒光的轉基因斑馬魚(zlyz:egfp)為模型，建立炎癥模型，評價昆海姜辛湯的體內抗炎活性。

研究表明，巨噬細胞是炎癥的重要調節(jié)細胞，通過定向募集和活化炎癥細胞，產(chǎn)生炎性介質，合成并釋放控制和調節(jié)氣道炎癥反應的細胞因子參與氣道炎癥過程，是許多免疫及炎性反應的始動環(huán)節(jié)，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，在炎癥中既是免疫調節(jié)細胞，又是免疫效應細胞[20]。因此，本文以昆海姜辛湯組分配伍對斑馬魚側線炎癥病灶中巨噬細胞數(shù)量的影響為依據(jù)，探討其抗炎作用。

本研究中，昆海姜辛湯合方的組分配伍溶液可以使硫酸銅誘導的斑馬魚炎癥模型的巨噬細胞的數(shù)量明顯減少，說明寒熱藥性配伍的昆海姜辛湯合方組分較寒寒組分配伍和熱熱組分配伍具有更顯著的抗炎作用。

昆海姜辛湯中，昆布、海藻屬于海洋植物類中藥。昆布性寒，具有消痰利水的作用，為君藥；海藻的作用與昆布類似，在方中與昆布起協(xié)同作用，為臣藥；干姜辛熱，具有溫中散寒、燥濕化痰的功效，治療痰飲喘咳；細辛辛溫，具有祛風散寒、溫肺化飲的功效，也可治療痰飲喘咳。干姜與細辛共為佐使藥，一方面可助昆布、海藻化痰，為佐助藥；另一方面可制約昆布、海藻的寒性，又可作為佐制藥；而且，兩位藥還可以引君臣二藥入肺經(jīng)而治療肺經(jīng)痰飲，因此還可作為使藥。昆海姜辛湯主要作用特點體現(xiàn)在寒溫并用，方中四味藥的配伍，使得全方寒溫適度，共奏化痰利水、止咳平喘之功[21]。

中藥方劑大多是多組分協(xié)同作用，通過多靶標調控進行整合調節(jié)。本研究結果提示，昆海姜辛湯中寒熱組分配伍的療效較單純寒寒配伍和熱熱配伍明顯，為中藥方劑的寒熱配伍提供了一定的實驗依據(jù)。

昆海姜辛湯作用的物質基礎、分子機制及配伍機制尚不十分明確，下一步的研究可以從疾病生物分子網(wǎng)絡的關鍵調控環(huán)節(jié)和靶標入手，從分子層次來識別昆海姜辛湯中寒熱組分的協(xié)同作用機制，為詮釋中藥寒熱配伍提供客觀的科學依據(jù)。

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Anti-inflammatory research on component combination of Kunhai ginger decoction based on zebrafish model

PENG Wei-bing1, ZHOU Ling-xiao1,2,3, FU Xian-jun2, HE Qiu-xia1, WANG Zhen-guo2,*, LIU Ke-chun1*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences, Biology Institute，Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014,China;2.Taishan Scholar Studio of Specialty of History and Literature of Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China;3.CSPC Antineoplastic Drug Company, Shijiazhuang 050035,China)

∶To study the anti-inflammatory effects of one marine medicine, compound Kunhai ginger decoction, whose component was prepared in different combination, zebrafish inflammatory model was established, induced by copper sulfate solution. The model was intervened by different concentrations of component combination solution from Kunhai ginger decoction (100, 50, 25 μg/mL) respectively, and its effect on the number of macrophage cell in zebrafish was observed by stereo fluorescence microscope. The results reveal that the number of macrophage cell in zebrafish inflammatory model induced by copper sulfate is reduced obviously due to the component combination solution from compound Kunhai ginger decoction, which hasinvivoanti-inflammatory effects.

∶Kunhai ginger decoction; component combination; zebrafish; anti-inflammatory

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.02.006

2017-02-07

山東省人力資源和社會保障廳博士后創(chuàng)新項目(201102036)

彭維兵(1980—)，男，博士，副研究員，研究方向為藥理學。E-mail: weibingpeng@hotmail.com

*通信作者，王振國(1963—)，男，教授，研究方向為中藥藥性理論與海洋中藥研究。E-mail:zhenguow@126.com 劉可春(1964—)，男，博士，研究員，研究方向為藥物篩選。E-mail:hliukch@sdas.org

R965.1;R282.77

A

1002-4026(2017)02-0037-06