李建軍+周劍忠++董月++夏秀東++王英

摘要：通過測定經(jīng)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FM-L1-3和明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）T-L1胞外多糖處理前后黑莓果酒中蛋白質(zhì)、總酚、花色苷、色度、澄清度以及熱穩(wěn)定性等參數(shù)的變化，研究乳酸菌胞外多糖處理對黑莓果酒品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，適量的乳酸菌胞外多糖處理黑莓果酒，能明顯降低導(dǎo)致果酒沉淀的蛋白質(zhì)、總酚含量，顯著提高果酒的澄清度和熱穩(wěn)定性，顯著延長果酒的儲存穩(wěn)定性，另外，胞外多糖處理降低了果酒的花色苷含量和果酒的色澤；相同含量的FM-L1-3和T-L1 胞外多糖處理果酒，對果酒品質(zhì)影響不同。與對照相比，乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒品質(zhì)均具有提升作用。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；胞外多糖；黑莓果酒；品質(zhì)

中圖分類號： TS262.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0178-04

黑莓果酒中富含多酚、黃酮、類黃酮、葉黃素、花青素、葉酸、微量元素錳等物質(zhì)，不僅可以提高人體免疫力，還能降血壓[1]。相對于葡萄酒，黑莓果酒不僅富含多酚類物質(zhì)，而且黑莓果酒有著更有效的體外抗氧化的功效[2]。黑莓果酒中的花青素可預(yù)防心血管病，降低中風(fēng)風(fēng)險，花青素和原花青素可有效改善血管健康狀況，減少動脈粥樣硬化，預(yù)防和降低冠心病和中風(fēng)的風(fēng)險。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強，兼具豐富營養(yǎng)和功能的黑莓果酒產(chǎn)業(yè)將會有很大的發(fā)展前景。

黑莓果酒在貯藏過程中存在一些品質(zhì)上的波動，例如出現(xiàn)渾濁、沉淀和色澤減弱。雖說果酒的輕微渾濁和少量沉淀對消費者的健康并沒有多大的影響，但是這將大大影響消費者購買意向。銷售量是每個產(chǎn)品生命力的體現(xiàn)，為了提高黑莓果酒的市場前景，必須大大提高黑莓果酒的儲存穩(wěn)定性。

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的黏液多糖和莢膜多糖的總稱[3-4]，具有改善發(fā)酵食品質(zhì)構(gòu)、口感、流變性、穩(wěn)定性、持水性等獨特的理化特性，同時還具有多種生物活性，具有抑菌、抗誘變、抗腫瘤、降膽固醇、調(diào)節(jié)腸胃功能等作用[5-8]。近年來對乳酸菌EPS的研究和開發(fā)引起廣大研究者和食品加工業(yè)的重視[9-11]。

目前，乳酸菌胞外多糖對果酒品質(zhì)的影響，尤其是果酒儲存穩(wěn)定性的影響還未見報道。本課題將探究2種乳酸菌多糖的添加對黑莓果酒中蛋白質(zhì)含量、總酚含量、花色苷含量、澄清度、色度、熱穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性的影響，分析乳酸菌胞外多糖對果酒品質(zhì)的影響，以期開發(fā)新的具有提高黑莓果酒品質(zhì)功效的物質(zhì)來源。

1材料與方法

1.1試驗材料

黑莓采自江蘇省南京市溧水區(qū)黑莓種植基地。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FM-L1-3和明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）T-L1，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室保存。

1.2試劑及儀器

試劑：福林酚（Folin-Phenol），SIGMA；沒食子酸，上海西隴化工有限公司；福爾馬肼濁度標(biāo)準(zhǔn)溶液，上海昕瑞儀器儀表有限公司；無水碳酸鈉，南京壽德試劑有限公司；

設(shè)備：紫外可見分光光度計UV-1600PC，上海美普達(dá)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；雙向磁力加熱攪拌器，江蘇金壇市中大儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1果酒制備工藝黑莓果清洗→打漿→配料（添加偏重亞硫酸鉀、果膠酶和蔗糖）→接種→發(fā)酵→過濾→澄清。

1.3.2乳酸菌培養(yǎng)及其胞外多糖的提取挑取活化后單菌落分別接種到液體MRS試管中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，傳代2次。按3%的接種量分別接種裝有液體MRS的三角瓶中，培養(yǎng)24 h。胞外多糖的提取方法參照文獻(xiàn)[12]并做適當(dāng)改進(jìn)。在4 ℃條件下離心去除菌體。上清液用蛋白酶脫除蛋白，再添加3倍體積的冷乙醇于上清液中，4 ℃ 下靜置過夜。冷凍離心得沉淀物，用冷乙醇洗滌沉淀物3～5次，利用透析袋（截留分子量為5 000～8 000）進(jìn)行透析處理，冷凍干燥得胞外多糖提取物。

1.3.3黑莓果酒的胞外多糖處理取黑莓果酒200 mL置于250 mL的試劑瓶中，按照胞外多糖終濃度分別為50、250、500 mg/L 將FM-L1-3和T-L1的胞外多糖分別加入到黑莓果酒中，充分混勻后，靜置5～7 d，經(jīng)4 500 r/min離心15 min，獲得胞外多糖處理的黑莓果酒，同時以未加多糖的黑莓果酒作為對照。試驗重復(fù)3次。

1.3.4果酒各理化指標(biāo)測定

1.3.4.1果酒中蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法，具體操作方法參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.4.2果酒中總酚含量測定采用Folin-酚試劑法，具體操作方法參照文獻(xiàn)[14]。

1.3.4.3果酒中總糖的測定采用苯酚硫酸法，具體操作方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.3.4.4花色苷的測定在2個 10 mL 的容量瓶里各加入 1 mL 稀釋后的黑莓果酒，分別用 pH值1.0的緩沖溶液（0.2 mol/L KCl，用HCl調(diào)pH值為1.0）及 pH值4.5（1 mol/L CH3COONa，用HCl調(diào)pH值為4.5）的緩沖溶液定容。將定容后的溶液放置在冰箱， 4 ℃避光靜置2 h 后，在波長510 nm及700 nm下測吸光度D，結(jié)果以矢車菊-3-O-葡萄糖苷計 [16]?；ㄉ蘸坑嬎愎剑?/p>

花色苷含量（mg/L）=（D×m×n×1 000）/（ε×L）。

式中：D=（D510 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0） -（D510 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5）；m為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2；n為稀釋倍數(shù)，10；ε為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900；L為比色皿的光程長度，1。

1.3.4.5色度的測量[17]將處理好的果酒倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，于420、520、620 nm 處測其吸光度，以三者吸光度之和表示色度。

1.3.4.6澄清度的測量將果酒倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，于680 nm處測其透光率，具體操作方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.3.4.7熱穩(wěn)定性測定[19]將處理好的果酒取5 mL置于試管中，置于80 ℃水浴中處理6 h后，取出放置在4 ℃下 16 h，然后在室溫下用濁度計測定其濁度值，以樣品熱處理后與熱處理前的濁度差值（ΔNTU）表示其熱穩(wěn)定性。

1.3.4.8果酒的儲存穩(wěn)定性根據(jù)前期的試驗結(jié)果，選擇終濃度為250 mg/L的FM-L1-3和T-L1的胞外多糖處理黑莓果酒，每隔3個月測定果酒的濁度值，分析時間為12個月，以未用胞外多糖處理的果酒為對照。

2結(jié)果與分析

2.1乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中蛋白質(zhì)含量的影響

一般來說，果酒中蛋白質(zhì)含量很低，不是果酒的主要營養(yǎng)成分，每升果酒中蛋白質(zhì)含量為幾十到幾百毫克之間。但是，已有的研究結(jié)果表明，果酒中蛋白質(zhì)是引起果酒渾濁的一個必要因素，且蛋白質(zhì)的含量越高，果酒越不穩(wěn)定，越易發(fā)生渾濁沉淀現(xiàn)象[20-22]，導(dǎo)致果酒的貨架期大大縮短。如何去除果酒中的蛋白質(zhì)，保持果酒的澄清穩(wěn)定性，延長果酒的貨架期，是目前果酒產(chǎn)業(yè)研究的一個熱點。

前人的研究結(jié)果顯示，向果酒中加入一些澄清劑，可以降低果酒中的蛋白質(zhì)含量，提高果酒的澄清穩(wěn)定性。Francois等利用皂土處理葡萄果酒，隨著皂土添加量的增加，果酒中蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)降低趨勢，當(dāng)皂土添加量達(dá)到0.5 g/L時，蛋白質(zhì)含量可以去除50%[23]。王英等利用皂土處理黑莓果酒，當(dāng)皂土用量為0.6 g/L時，蛋白質(zhì)的去除率達(dá)到62.4%[24]。另外，添加單寧也會不同程度地降低果酒中的蛋白質(zhì)含量。本研究中乳酸菌胞外多糖的添加對果酒中蛋白質(zhì)含量的影響見圖1。從圖1可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的蛋白質(zhì)含量整體呈現(xiàn)減少趨勢。與對照相比，當(dāng)胞外多糖添加量為500 mg/L時，F(xiàn)M-L1-3胞外多糖處理的果酒中蛋白質(zhì)含量降低了35.82%，T-L1胞外多糖處理的果酒中蛋白質(zhì)含量降低了46.06%。可見，乳酸菌胞外多糖具有優(yōu)良的去除果酒中蛋白質(zhì)的功能，且不同乳酸菌的胞外多糖去除果酒中蛋白質(zhì)能力不同。

2.2乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中總酚含量的影響

酚類物質(zhì)是果酒中一個重要組成部分，也是一個重要的功能成分，對果酒的感觀特性（顏色、風(fēng)味、苦味等）有重要貢獻(xiàn)，由于其具有抗氧化、抑菌、抗炎癥等功能活性而備受關(guān)注[25-26]。同時已有的研究表明，酚類物質(zhì)也是引起果酒沉淀的一個重要的非生物因素[27-28]。添加不同的澄清劑，對果酒中的酚類物質(zhì)也具有不同程度的降低作用，進(jìn)而達(dá)到提高澄清穩(wěn)定性的作用。通常用聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）去除果酒中的酚類物質(zhì)，通過氫鍵與酒中的酚類物質(zhì)絡(luò)合，對小分子物質(zhì)具有很強的吸附能力。乳酸菌胞外多糖的添加對果酒中總酚含量的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的總酚含量整體呈現(xiàn)減少趨勢。與對照相比，當(dāng)胞外多糖添加量為500 mg/L時，F(xiàn)M-L1-3胞外多糖處理的果酒中總酚含量降低了24.34%，T-L1胞外多糖處理的果酒中總酚含量降低了32.71%。可見，乳酸菌胞外多糖具有較好的去除果酒中總酚的功能，且不同乳酸菌的胞外多糖去除果酒中總酚能力不同。

2.3乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中總糖含量的影響

從圖3可以看出，在FM-L1-3的胞外多糖含量添加量為0～250 mg/L時，果酒體系中的總糖含量變化不大，當(dāng)多糖含量添加為500 mg/L時，果酒體系中總糖含量反而增加了2.91%。T-L1的胞外多糖含量添加量為0～250 mg/L時，果酒體系中的總糖含量呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)多糖含量添加為500 mg/L時，果酒體系中總糖含量與對照相比保持一致?？傮w來說，乳酸菌胞外多糖對果酒中的總糖含量影響不大。

2.4乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒中花色苷含量的影響

果酒顏色是果酒的一個重要感官品質(zhì)，也是判斷果酒酒齡的一個重要依據(jù)，花色苷是賦予果酒顏色的一類主要化合物。另外，花色苷是一種功能性水溶色素，具有抗氧化、清除自由基等多種生理活性[5]。乳酸菌胞外多糖的添加對果酒中花色苷含量的影響見圖4。從圖4可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的花色苷含量整體呈現(xiàn)減少趨勢。與對照相比，當(dāng)胞外多糖添加量為500 mg/L時，F(xiàn)M-L1-3胞外多糖處理的果酒中花色苷含量降低了12.57%，T-L1胞外多糖處理的果酒中花色苷含量降低了15.43%。結(jié)果顯示，乳酸菌胞外多糖能夠不同程度地降低果酒中的花色苷含量，且不同乳酸菌的胞外多糖對果酒中花色苷的影響能力不同。

2.5乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒色澤的影響

從圖5可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒中的色澤整體呈現(xiàn)減少趨勢。這是由于胞外多糖的加入，降低了果酒中呈色物質(zhì)（酚類物質(zhì)和花色苷）含量，進(jìn)而導(dǎo)致了果酒色澤的降低。從圖5中還可以看出，乳酸菌FM-L1-3 和

T-L1的胞外多糖添加相同含量，但對果酒的色澤影響不同，相同含量胞外多糖處理果酒，乳酸菌 T-L1的胞外多糖對果酒的色澤影響更大，這與乳酸菌 T-L1胞外多糖處理對果酒中的酚類物質(zhì)和花色苷物質(zhì)的影響趨勢相同，T-L1胞外多糖對多酚和花色苷含量的影響更大。

2.6乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒的澄清度的影響

果酒澄清度是果酒的一個重要感官品質(zhì)，雖然很多果酒商品都會標(biāo)注有少許沉淀不影響飲用。但是，帶有沉淀或少許渾濁的果酒會影響消費者的購買欲。乳酸菌胞外多糖的添加對果酒澄清度的影響見圖6。從圖6可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒澄清度整體呈現(xiàn)增加趨勢。與對照相比，當(dāng)胞外多糖添加量為500 mg/L時，F(xiàn)M-L1-3胞外多糖處理使黑莓果酒的澄清度增加了15.53%，T-L1胞外多糖處理使黑莓果酒的澄清度提高了22.12%。這與T-L1和FM-L1-3胞外多糖處理時對影響果酒澄清穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的結(jié)果一致，前面的研究結(jié)果顯示，相同含量的胞外多糖處理，T-L1胞外多糖處理對果酒中蛋白質(zhì)和總酚含量的去除能力更強。

2.7乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒熱穩(wěn)定性的影響

從圖7可以看出，隨著胞外多糖添加量的增多，果酒的熱穩(wěn)定性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與對照相比，胞外多糖的添加能夠降低ΔNTU值，增加黑莓果酒的穩(wěn)定性，但是，不同胞外多糖的添加量和不同乳酸菌的胞外多糖對果酒的熱穩(wěn)定性的影響不同。從圖7可以看出，T-L1胞外多糖添加量為50～250 mg/L時，ΔNTU的值最小，黑莓果酒的熱穩(wěn)定性最高，當(dāng)繼續(xù)增加胞外多糖，ΔNTU的值開始增大，熱穩(wěn)定性開始降低，試驗結(jié)果顯示，并不是果酒中總酚物質(zhì)、蛋白質(zhì)含量、花色苷含量越低，果酒穩(wěn)定性越高，這可能是由于影響果酒澄清穩(wěn)定性的因素除了蛋白質(zhì)、總酚和花色苷物質(zhì)之外，還有其他的因素起到重要作用，這將在后續(xù)的研究工作中做進(jìn)一步的探討和分析。

2.8乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒儲存穩(wěn)定性的影響

果酒貨架期澄清度的穩(wěn)定性是影響果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。乳酸菌胞外多糖的添加對黑莓果酒儲存期澄清度的影響見圖8。從圖8可以看出，隨著儲存時間的延長，不同處理的果酒的NTU值增大，可見，隨著儲存時間的延長，果酒的澄清度呈現(xiàn)下降趨勢。從圖8還可以看出，與對照相比，在相同的儲存時間內(nèi)， 胞外多糖添加能顯著提高果酒澄清度的穩(wěn)定

性；另外，T-L1胞外多糖處理效果要高于同等濃度的FM-L1-3胞外多糖的處理效果。

3結(jié)論

本研究測定了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）FM-L1-3 和明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）T-L1胞外多糖處理前后黑莓果酒中蛋白質(zhì)、總酚、花色苷、色度、澄清度以及熱穩(wěn)定性等參數(shù)的變化，結(jié)果表明，適量的乳酸菌胞外

多糖處理黑莓果酒，能明顯降低導(dǎo)致果酒沉淀的蛋白質(zhì)、總酚含量，顯著提高果酒的澄清度和熱穩(wěn)定性，顯著延長果酒的儲存穩(wěn)定性，另外，胞外多糖處理降低了果酒的花色苷含量和果酒的色澤。

相同含量的FM-L1-3和T-L1 胞外多糖處理黑莓果酒，對果酒品質(zhì)影響不同，說明不同的乳酸菌胞外多糖對黑莓果酒品質(zhì)影響不同。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.048