夏一赫,杭柏林,黃東明,張冰清,徐彥召,胡建和

牛蛙背皮抗菌肽粗提物的抑菌活性

夏一赫,杭柏林,黃東明,張冰清,徐彥召,胡建和

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

研究旨在分析牛蛙背皮抗菌肽粗提物的抑菌活性.通過甲醇浸提法制備了牛蛙背部皮膚的抗菌肽粗提物,以瓊脂糖擴(kuò)散法檢測粗提物的抑菌活性,用倍比稀釋法測定粗提物的最小抑菌濃度（MIC）,通過測定生長曲線和殺菌動(dòng)力學(xué)曲線分析粗提物的抑菌特性,借助顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色變化,用pH計(jì)測定細(xì)菌培養(yǎng)基的pH值.結(jié)果表明：牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性,MIC分別為62.5μg/mL和31.25μg/mL,但對白色念珠菌沒有抑菌活性；在低質(zhì)量濃度（1×MIC）時(shí),在遲緩期沒有抑菌活性,但從對數(shù)期開始發(fā)揮抑菌活性；在高質(zhì)量濃度（3×MIC）時(shí),10 min內(nèi)即開始發(fā)揮抑菌活性；粗提物作用后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)相反的革蘭染色結(jié)果,菌體形態(tài)從桿狀或球狀變?yōu)榻z狀；培養(yǎng)2 h后,粗提物可提高大腸桿菌培養(yǎng)液的pH值,但對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的pH值沒有影響.結(jié)果提示,牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性,為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

牛蛙背皮；抗菌肽粗提物；最小抑菌濃度；抑菌活性；細(xì)菌形態(tài)；生長曲線

我國是動(dòng)物養(yǎng)殖大國,但在養(yǎng)殖過程中,眾多動(dòng)物疫病時(shí)常發(fā)生,不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也影響了人們的日常生活[1].動(dòng)物發(fā)生疫病后一般使用藥物進(jìn)行治療,其中抗生素的用量較大.但是,隨著抗生素的大量使用或?yàn)E用,病原的耐藥性問題日益突出,某些病原甚至出現(xiàn)了超級耐藥現(xiàn)象[2-3].同時(shí),抗生素殘留對環(huán)境和人類健康造成的危害日益嚴(yán)重[4].因此,尋找安全、高效、低耐藥、無殘留的抗生素或抗生素替代物已經(jīng)成為藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5].生物機(jī)體中存在許多天然抗病原微生物的活性成分,如抗菌肽、干擾素、天然抗體、酸性物質(zhì)、活性酶、細(xì)菌素等.針對這些天然活性成分的研究是尋找抗生素替代物的有效途徑[6-7].許多兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟有抗微生物、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)等多種功能的活性物質(zhì)[8-9].以兩棲類動(dòng)物為來源的制劑的傳統(tǒng)中藥已經(jīng)在臨床上得到了廣泛應(yīng)用.牛蛙是一種兩棲類動(dòng)物,生存環(huán)境中存在著各種微生物,其主要通過產(chǎn)生各種活性物質(zhì)來抗病原、保健康.如牛蛙皮膚中存在的活性物質(zhì)能夠殺滅假單胞細(xì)菌及清除其他炎癥細(xì)菌,比常用抗菌素的效力還高[9-10].牛蛙體內(nèi)存在著許多抗菌肽類物質(zhì)[7],對保護(hù)牛蛙健康具有重要作用.因此,從牛蛙皮膚中獲取抗菌活性物質(zhì)對尋找抗生素替代物具有重要意義.本研究制備了牛蛙背部皮膚抗菌肽粗提物,并對其抑菌特性進(jìn)行了初步分析,為后續(xù)深入研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 牛蛙與供試菌株

成年健康虎紋蛙購自河南省新鄉(xiāng)市某大型超市.受試菌株為大腸桿菌ATCC8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538和白色念珠菌ATCC10231,由河南科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 主要試劑和儀器

蛋白胨、牛肉膏、營養(yǎng)瓊脂、LB培養(yǎng)基、無水乙醇、革蘭染色試劑、甲醇等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑.生物顯微鏡（淄博森源電氣有限公司）,高壓蒸餾滅菌器（Hirayama公司）,電子天平（sartorius公司）,微量移液器（eppendorf公司）,超低溫冰箱、高速冷凍離心機(jī)、純水儀、酶標(biāo)儀均為Thermo Scientific公司生產(chǎn),制冰機(jī)（SANYO公司）,組織勻漿機(jī)（T18 basic公司）,超微量蛋白核酸分析儀（BioDrop公司）,pH計(jì)（上海雷磁）.

1.3 牛蛙背皮抗菌肽粗提物的制備

牛蛙背皮抗菌肽粗提物的制備參照文獻(xiàn)[11]中的方法進(jìn)行.制備過程簡述如下：將活體牛蛙用蒸餾水清洗干凈,用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇棉球擦拭,用滅菌去離子水充分沖洗,毀髓,迅速剝離背部皮膚,用滅菌去離子水沖洗3次,用滅菌手術(shù)剪將背部皮膚剪成小塊,浸于體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液中,冰上勻漿、超聲破碎,4℃浸提60 h,10 000 r/min離心10 min,收集上清,將沉淀置通風(fēng)廚內(nèi)繼續(xù)浸提,重復(fù)3次,將所有上清混合后置冰上于通風(fēng)櫥中使甲醇揮發(fā),冷凍干燥,-80℃保存.使用時(shí),用滅菌去離子水溶解粗提物粉末,立即使用或4℃保存?zhèn)溆?

1.4 種子菌的制備

將3種受試菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)（180 r/min）約12 h,4℃保存,備用.

1.5 粗提物抗菌活性的檢測

采用雙層瓊脂擴(kuò)散法[12-13]檢測牛蛙背皮粗提物的抗菌活性.將種子菌株接種于LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)（180 r/min）3～6 h,調(diào)整菌液OD600值為0.5～0.6.取50μL菌懸液加入50℃左右的20 mL底層培養(yǎng)基（TSB）中,混勻,倒入培養(yǎng)皿（Ф為10 cm）中,冷卻,打孔（Ф為4 mm）.陽性對照孔中加20μL卡那霉素（62.5μg/mL）,陰性對照孔加20μL滅菌去離子水,其余孔加入20μL粗提物（8 mg/mL）,倒置,37℃培養(yǎng)3 h,取出,倒入50℃左右的10 mL上層TSB培養(yǎng)基,凝固后,倒置,37℃培養(yǎng)過夜或48 h,測量抑菌圈直徑.

1.6 粗提物最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用二倍稀釋法[14]測定MIC.用LB液體培養(yǎng)基將粗提物（8 mg/mL）進(jìn)行0、2、4、8、16、32、64、128和256倍稀釋,取200μL稀釋液加入96孔酶標(biāo)板中,每個(gè)稀釋度4個(gè)重復(fù),每孔中加入10μL受試菌懸液（OD600值為0.5～0.6）.同時(shí)設(shè)陽性對照（LB液體培養(yǎng)基+受試菌）、陰性對照（僅為LB液體培養(yǎng)基）, 37℃培養(yǎng)24 h,從每孔中取培養(yǎng)液測定OD600值.以O(shè)D值突然變化對應(yīng)的質(zhì)量濃度為粗提物的MIC.

1.7 粗提物抑菌特性的測定

一種方法是采用低質(zhì)量濃度（1×MIC）的粗提物進(jìn)行長時(shí)抑菌特性分析,即生長曲線測定法[15].在酶標(biāo)板的每孔中加入200μL的LB液體培養(yǎng)基,4排孔的每孔加入10μL受試菌懸液（OD600值為0.5～0.6）和10μL的LB液體培養(yǎng)基,4排孔的每孔加入10μL粗提物（1×MIC）和10μL受試菌懸液（OD600值為0.5～0.6）,37℃培養(yǎng)（180 r/min）16 h,每2 h取每列孔中的液體懸液測定OD600值.另一種方法是采用高質(zhì)量濃度（3×MIC）的粗提物進(jìn)行短時(shí)抑菌特性分析,即殺菌動(dòng)力學(xué)測定法[14].取200μL菌液（OD600值為0.5～0.6）加入10列孔中,4排孔的每孔中加入30μL的LB液體培養(yǎng)基和30μL粗提物（3×MIC）,作用0、10、20、30、40、50、60、70、110和150 min,混勻,每孔取10μL加入到200μL的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,測定OD600值.以時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D600值為縱坐標(biāo),繪制受試菌的生長曲線.比較生長曲線特征,分析粗提物的抑菌特性.

1.8 受試菌的形態(tài)觀察

取粗提物長時(shí)抑菌特性試驗(yàn)中培養(yǎng)4 h的菌懸液進(jìn)行涂片、革蘭染色,用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)變化.

1.9 培養(yǎng)液p H值的測定

在5 mL的LB液體培養(yǎng)基中加入0.25 mL的菌液（OD600值為0.5～0.6）,4個(gè)試管中加入0.25 mL的粗提物（1×MIC）,4個(gè)試管中加入0.25 mL的LB液體培養(yǎng)基,分別于培養(yǎng)（37℃）后0、2、5、9 h測定pH值.

2 結(jié)果與分析

2.1 粗提物的抑菌活性

通過瓊脂糖擴(kuò)散法檢測牛蛙背皮抗菌肽粗提物的抑菌活性,其結(jié)果如表1所示.牛蛙背皮抗菌肽粗提物具有抗革蘭陽性菌和抗革蘭陰性菌的活性,其中對大腸桿菌的抑菌活性較高,但不具有抗真菌活性.

表1 牛蛙背皮抗菌肽粗提物的抑菌活性Tab.1 Antibacterialactivity ofantimicrobialpeptide crude extractfrom bullfrog skin ofback

2.2 粗提物的最小抑菌濃度（MIC）

以二倍稀釋法測定粗提物的MIC.以粗提物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以對應(yīng)菌液的OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行折線圖繪制,結(jié)果如圖1所示.粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為62.5μg/mL和31.25μg/mL.

圖1 牛蛙背皮抗菌肽粗提物的MICFig.2 MICofanimicrobialpeptide crude extractfrom bullfrog skin ofback

2.3 粗提物（1×MIC）的長時(shí)抑菌特性

通過測定細(xì)菌生長曲線的方法觀察牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,如圖2所示.從圖2可以看出,在2 h內(nèi),試驗(yàn)組和對照組的OD值是基本一致的；對照組的細(xì)菌在2 h后進(jìn)入對數(shù)期,到14 h基本到達(dá)穩(wěn)定期；而大腸桿菌試驗(yàn)組的細(xì)菌在2 h后OD值基本沒有變化,金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組的細(xì)菌在4 h后OD值基本沒有變化.這表明,牛蛙背皮抗菌肽粗提物中的活性物質(zhì)抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長與繁殖.

圖2 牛蛙背皮抗菌肽粗提物（1×MIC）的抑菌效果Fig.2 Effects ofantimicrobialpeptide crude extractfrom bullfrog skin ofback with the dose of1×MIC

2.4 粗提物（3×MIC）的短時(shí)抑菌特性分析

分析牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌動(dòng)力學(xué)特征可知,粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅率達(dá)到最高值所需要的時(shí)間分別是110 min和150 min（見圖3）.這表明,牛蛙背皮抗菌肽粗提物的殺菌作用具有一定的時(shí)間依賴性.

圖3 牛蛙背皮抗菌肽粗提物（3×MIC）的殺菌動(dòng)力學(xué)特征Fig.3 The kiling kinetics ofantimicrobialpeptide crude extractfrom bullfrog skin ofback with the dose of3×MIC

2.5 粗提物對細(xì)菌形態(tài)與染色的影響

將正常培養(yǎng)的和粗提物處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌通過革蘭染色法染色,于油鏡下觀察,結(jié)果如圖4所示.從圖4中可以看出,正常的大腸桿菌呈紅色,為革蘭陰性,細(xì)菌呈桿狀,大小正常,而粗提物處理的大腸桿菌呈紫色,為革蘭陽性,細(xì)菌體積變大或呈長絲狀；正常的金黃色葡萄球菌呈紫色,為革蘭陽性,呈典型的葡萄球菌的形態(tài),而粗提物處理的金黃色葡萄球菌呈紅色或紅紫色,為革蘭陰性,出現(xiàn)細(xì)絲狀的細(xì)菌形態(tài).這表明,牛蛙背皮抗菌肽粗提物可以改變細(xì)菌的染色結(jié)果和形態(tài)特征.

圖4 牛蛙背皮抗菌肽粗提物細(xì)菌形態(tài)的影響（1 000×）Fig.4 Effects ofantimicrobialpeptide crude extractfrom bullfrog skin ofback on morphology（1 000×）

2.6 粗提物對細(xì)菌培養(yǎng)液p H值的影響

分析牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液pH的影響,結(jié)果見圖5.在2 h內(nèi),細(xì)菌培養(yǎng)液的pH值沒有產(chǎn)生顯著變化.2 h后,粗提物作用組大腸桿菌培養(yǎng)基的pH值高于對照組（圖5-a）,但在9 h內(nèi),粗提物對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的pH卻沒有產(chǎn)生顯著影響（圖5-b）.這表明,牛蛙背皮抗菌肽粗提物可以影響大腸桿菌培養(yǎng)液的pH值,但對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的pH值沒有影響.

圖5 牛蛙背皮抗菌肽粗提物對培養(yǎng)液p H值的影響Fig.5 Effects ofantimicrobialpeptide crude extractfrom bullfrog skin ofback on pH

3 結(jié)論與討論

牛蛙是一種兩棲類動(dòng)物,其生存環(huán)境比較復(fù)雜,在生活過程中常受到多種微生物的侵襲.皮膚是抵擋微生物侵入機(jī)體的第一道天然防線[16].皮膚由表皮層、真皮層和皮下組織構(gòu)成,其中含有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞等與免疫有關(guān)的免疫細(xì)胞,通過不同的分子發(fā)揮抗病原微生物的作用[17].因此,牛蛙皮膚中存在著很多的抗菌活性物質(zhì),如抗菌肽類物質(zhì).在抗生素應(yīng)用泛濫、耐藥性菌株不斷出現(xiàn)的情況下,對牛蛙皮膚中的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行研究具有重要的意義.本研究證明了牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性.

抗菌活性物質(zhì)與細(xì)菌作用后,細(xì)菌的生長會(huì)受到抑制或被殺死[7].牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制效應(yīng)主要出現(xiàn)在對數(shù)期.通過光學(xué)顯微鏡的觀察,粗提物作用4 h后,菌體形態(tài)和染色特性發(fā)生變化,從而影響了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長.粗提物作用于大腸桿菌后,菌液的OD值在作用2 h時(shí)有微弱增加,而后一直很低,幾乎不變.而粗提物作用于金黃色葡萄球菌后,菌液的OD值卻隨著時(shí)間延長仍有微弱的增加,這種微弱增加可能是殘留的金黃色葡萄球菌（如圖4-d中,呈紫色球形的菌體）在生長.在殺菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)中,金黃色葡萄球菌菌液的OD值下降速度比大腸桿菌緩慢.pH值變化可以綜合反映細(xì)菌在生長繁殖過程中的代謝活動(dòng)[18].在2 h內(nèi),牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基的pH值沒有產(chǎn)生影響,這與生長曲線方法的檢測結(jié)果（2 h內(nèi)沒有變化）基本一致.2 h后,粗提物對大腸桿菌培養(yǎng)過程中的pH值產(chǎn)生了影響,但對金黃色葡萄球菌的pH值沒有影響.由此可以推測,粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制是不同的.

抗菌肽是生物體抵御外來病原入侵時(shí)誘導(dǎo)合成的一系列具有抗菌活性的小分子多肽,以獨(dú)特的作用機(jī)制提高動(dòng)植物的抗病能力,并有望解決抗生素耐藥性問題[19].蛙的皮膚中有多種類型的抗菌肽,如brevinin-1～2、esculentin-1～2、ranatuerin-1～2、temporin、palustrin-1～3、tigerinin、japonicin-1～2、nigrocin-2等[7].牛蛙背皮抗菌肽粗提物是一種混合物質(zhì),其中含有較多的抗菌多肽,但哪種抗菌肽發(fā)揮了主要作用,還需要進(jìn)行抗菌物質(zhì)的分離、鑒定等后續(xù)研究.

牛蛙背皮抗菌肽粗提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性,可影響細(xì)菌的形態(tài)和染色特性,表現(xiàn)出成為抗生素替代物的應(yīng)用潛力.對于牛蛙背皮抗菌肽粗提物的具體抗菌機(jī)制還需要進(jìn)行深入研究,以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

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（責(zé)任編輯：盧奇）

Bacteriostatic activity of antimicrobial peptide crude extract from bullfrog skin of back

XIA Yihe,HANG Bolin,HUANG Dongming,ZHANG Bingqing,XU Yanzhao,HU Jianhe
（SchoolofAnimalScience and Veterinary Medicine,Henan Institution of Science and Technology, Xinxiang 453003,China）

The bacteriostatic activity of antimicrobial peptide crude extract from bullfrog skin of back was analyzed in this paper.Antimicrobial peptide crude extract was prepared with methanol extraction.Antibacterial activity of crude extract was detected with agarose diffusion method.Minimal inhibition concentration of crude extract was measured with double dilution method.Antibacterial property of crude extract was assayed with growth curve and killing kinetics of bacterium.Morphological and color changes of bacteria treated with crude extract were observed with microscope.The pH value of bacterial cultural liquid was determined with pH meter.The results showed that antimicrobial peptide crude extract from bullfrog skin of back had antibacterial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus with the MIC of 62.5μg/mL and 31.25μg/mL respectively,but had no activity against Candida albicans.Crude extract with low concentration（1×MIC）had no activity in lag phase,but had activity from logarithmic phase.While crude extract with high concentration（3×MIC）had activity within 10 min.Compared with normal bacteria,the Gram stained results of E.coli and S.aureus treated with crude extract were opposite,and the morphology were changed from rhabditiform or sphericity to filiform.And the pH value of cultural liquid of E.coli treated with crude extract was high than control group,while there were no changes significantly on the pH value of cultural liquid of S.aureus.These findings indicated that antimicrobial peptide crude extract from bullfrog skin ofback had bacteriostatic activity against E.coli and S.Aureus,which lay a good foundation for following research and clinical practice.

bullfrog skin of back；antimicrobial peptide crude extract；minimum inhibition concentration；bacteriostatic activity；bacterial form；growth curve

S852.4

A

1008-7516（2017）02-0043-07

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.02.010

2016-09-26

河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（15IRTSTHN）；河南科技學(xué)院高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目（2014020）；河南科技學(xué)院2016年大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2016CX045）

夏一赫（1988―）,男,河南商丘人,碩士生.主要從事動(dòng)物病原的研究.

胡建和（1968―）,男,河南輝縣人,博士,教授.主要從事動(dòng)物病原與新獸藥的研究.