張繼州+周春權+李細彬+雷華杰+韓靜+賀肇東+胡娟
【摘要】目的:研究畬藥“十二時辰”水煎劑對小鼠的急性毒性,以初步評價其安全性。方法:以不同劑量“十二時辰”水煎劑對小鼠灌胃,觀察毒性癥狀,記錄死亡情況,并計算最大耐受量(MTD)、最小致死量(MLD)及半數(shù)致死量(LD50)的值。結果:小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)為2744g/kg,最小致死量(MLD)為392g/kg,半數(shù)致死量(LD50)為6008g/kg。結論:“十二時辰”臨床應用時,需嚴格控制口服劑量。
【關鍵詞】十二時辰;急性毒性;最大耐受量;最小致死量;半數(shù)致死量
【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517(2017)08-0027-03
“十二時辰”為毛茛科植物重瓣鐵線蓮Clematis florida Thunb var.plena DDon的干燥根[1],為福建福安畬醫(yī)習用藥。《福安畬醫(yī)畬藥》記載,其性溫、味辛,具有通經(jīng)活絡、通關竅、怯風除濕、活血止痛、理氣通便、利尿、解毒等功效,主治跌打損傷,關節(jié)腫痛,蟲蛇咬傷[2];《中華本草》記載其“味苦、微辛; 性溫,小毒,歸肝、脾、腎經(jīng),可利尿、通絡、理氣通便、解毒”,主治風濕性關節(jié)炎、小便不利、閉經(jīng)、便秘腹脹、風火牙痛、眼起星翳、蟲蛇咬傷、黃疸等[3],是一味地方特色鮮明的民族藥,值得進一步研究并加以開發(fā)應用。關于十二時辰的化學成分,近年已有相關報道[4-5],其主要活性成分包括棕櫚酸及其甲酯、乙酯以及齊墩果酸等。但迄今為止,對于“十二時辰”及其原植物重瓣鐵線蓮的安全性評價還未見文獻報道。研究通過小鼠口服不同劑量“十二時辰”水煎劑,觀察毒性癥狀,記錄死亡情況,并計算最大耐受量(MTD)、最小致死量(MLD)及半數(shù)致死量(LD50)的值,為其臨床安全使用奠定基礎。
1儀器與材料
11儀器與試藥YP502N電子天平(上海精密科學有限公司)、WK2102電磁爐(美的),“十二時辰”生藥(批號:20160501)購買自福建福安。
12實驗動物清潔級昆明種小鼠,雌雄各半,體重20~22g,購自上海斯萊克實驗動物中心(合格證號:SCXK(滬)2012-0002),光暗周期12/12 h(光照時間8∶00~20∶00)下飼養(yǎng),自由飲食,室溫保持 18~22℃,相對濕度 40%~70% ,實驗前適應性喂養(yǎng)3d。
2方法
21水煎劑制備用電子天平稱取“十二時辰”藥材400g,加水12倍體積煎煮1h,再先后加水10倍體積和8倍體積各煎煮05h,合并三次煎煮液,濃縮至200mL,即得2g/mL濃縮液備用,用時再用蒸餾水配成相應濃度。
22最大耐受量和最小致死量的測定預試驗中,80g/kg劑量的“十二時辰”水煎劑灌胃造成小鼠全部死亡,而8g/kg及08g/kg兩劑量無死亡。因此正式試驗中,在80g/kg和8g/kg劑量之間,以070等比組距,設置5個劑量組,其劑量分別為56g/kg、392g/kg 、2744g/kg、192g/kg、1344g/kg。
實驗動物隨機分為5個實驗組及1個空白對照組,每組10只,雌雄各半,實驗前禁食不禁水16h。各實驗組按04mL/10g體重灌胃給予上述劑量“十二時辰”水煎劑,空白對照組給予等體積的蒸餾水,觀察其毒性癥狀,記錄死亡情況,確定小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)和最小致死量(MLD)。
23LD50的測定參考22結果,經(jīng)預試驗,得出小鼠口服“十二時辰”水煎劑的100%致死量(Dm)為64 g/kg,0%致死量(Dn)為328g/kg,兩者之比接近2倍。故根據(jù)改良寇氏法(Krber氏法)[6],參考Dm和Dn,以085等比組距,設置6個劑量組,其劑量分別為753g/kg、64g/kg、544g/kg、462g/kg、393g/kg、334g/kg。
實驗動物隨機分為6個實驗組及1個空白對照組,每組10只,雌雄各半,實驗前禁食不禁水16小時。各實驗組按04mL/10g體重灌胃給予上述劑量“十二時辰”水煎劑,空白對照組給予等體積的蒸餾水,觀察其毒性癥狀,記錄死亡情況,并計算小鼠口服“十二時辰”水煎劑的半數(shù)致死量(LD50)。
24統(tǒng)計描述及LD50計算方法實驗數(shù)據(jù)以各實驗組動物死亡率表示,LD50采用改良寇氏法計算,計算公式如下:
LD50=log-1{Xm-i[∑p-(3-pm-pn)/4]}
其中:Xm為最大劑量組劑量的對數(shù);i為相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對數(shù);p為各組動物的死亡率;∑p為各組p值之和;pm為最高劑量組死亡率;pn為最低劑量組死亡率。
LD50的95%可信區(qū)間計算公式如下:
LD50的95%可信區(qū)間=LD50±45LD50·i∑p-∑p21n-1
其中:i為相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對數(shù);p為各組動物的死亡率;n為每組的動物數(shù)量。
3結果
31一般情況觀察空白對照組小鼠精神良好,活動正常,無死亡?!笆r辰”水煎劑組隨劑量升高,有靜伏不動、活動減少,死亡前抽搐等毒性現(xiàn)象。
32最大耐受量和最小致死量的測定由表1可知,小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)為2744 g/kg,最小致死量(MLD)為392g/kg。
33“十二時辰”水煎劑的LD50的測定各組死亡情況見表2根據(jù)改良寇氏法,將表2數(shù)據(jù)代入計算公式得:LD50=6008 g/kg;LD50的95%可信區(qū)間為5442~6573g/kg。
4討論
急性毒性試驗是藥物安全性評價的第一步,為后續(xù)的長期毒性試驗、特殊毒性試驗及藥效學、藥理學研究中劑量選擇和指標設計提供重要的參考依據(jù),同時也為臨床安全應用奠定基礎。
半數(shù)致死量LD50是藥物的重要特征性參數(shù),準確測定LD50是合理用藥、安全用藥的重要前提[6]。本次試驗滿足三個條件:①反應量大致呈正態(tài)分布;②給藥濃度按照等比級數(shù)排列;③各組動物數(shù)相等,故采用改良寇氏法(Krber 氏法)作為LD50的計算方法。然而單純依靠LD50作為急性毒性指標具有一定的缺陷,例如,無法反映不引發(fā)動物死亡的劑量與引發(fā)動物死亡的劑量之間的范圍。因此,配合最大耐受量(MTD)及最小致死量(MLD)等相關數(shù)據(jù),可以反映藥物毒作用帶的寬度,更全面地表示藥物的毒性。研究中,小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)為2744 g/kg,最小致死量(MLD)為392g/kg,半數(shù)致死量(LD50)為6008 g/kg,其95%可信區(qū)間為5442~6573g/kg。按照藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算,半數(shù)致死量(LD50)的值相當于60kg體重成人服用2920g生藥[7],根據(jù)化學物質(zhì)的急性毒性分級標準,該藥材屬低毒藥材。LD50約為MLD的兩倍,說明口服“十二時辰”水煎劑后,自出現(xiàn)小鼠死亡的最低劑量至半數(shù)小鼠死亡的劑量存在一定距離,毒劑量帶有一定的寬度。此外,小鼠口服“十二時辰”后的毒性現(xiàn)象可知,在致死劑量下其毒作用較為明顯,但具體的機制以及靶器官尚需要進一步實驗研究加以確認,并與同為鐵線蓮屬的其他藥用植物加以對比。
參考文獻
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[7]黃繼漢,黃曉暉,陳志揚,等.藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J]. 中國臨床藥理學與治療學,2004,9 (9):1069.
(收稿日期2017-02-17:編輯:梁志慶)