秦艷杰，王文文，王艷楓，李霞

（1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

仿刺參體壁再生過(guò)程中兩個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)差異

秦艷杰1，2，王文文1，王艷楓2，李霞1，2

（1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

本研究首次從仿刺參（Apostichopus japonicus）體壁中克隆得到核糖體蛋白L30（ribosomal protein L30，RPL30）的cDNA全長(zhǎng)序列（GenBank：JQ770165），該序列包括56 bp的5′-UTR，162 bp的3′-UTR和339b p的開(kāi)放閱讀框，共編碼112個(gè)氨基酸；Blast比對(duì)分析結(jié)果顯示該序列的核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種的同源性均在75%以上；RPL30基因在仿刺參各組織中均有表達(dá)，其中腸、體腔細(xì)胞、縱肌、體壁中表達(dá)量分別為呼吸樹(shù)的7.24倍（P<0.01）、4.47倍（P<0.01）、3.12倍（P<0.05）、1.35倍（P>0.05）；仿刺參體壁再生不同階段核糖體蛋白基因RPL30和RPL17的表達(dá)存在差異，體壁再生第7 d時(shí)RPL30基因的表達(dá)出現(xiàn)峰值，為對(duì)照組的2.13倍（P>0.05），其余天數(shù)的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，其中第1、5、6d的表達(dá)量與對(duì)照組差異均顯著（P<0.05）；RPL17基因在再生第2、5d分別出現(xiàn)峰值，分別為對(duì)照組的7.47倍和5.60倍（P< 0.05），其余各天的表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。研究結(jié)果表明核糖體蛋白基因除構(gòu)成核糖體參與蛋白質(zhì)合成外，還有著各自的核糖體外功能。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究仿刺參蛋白質(zhì)合成、再生及多種生理活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

仿刺參；核糖體蛋白L30；基因克??；核糖體蛋白L17；再生

仿刺參又稱(chēng)刺參，屬棘皮動(dòng)物門(mén)（Echinodermata），海參綱（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirotida），刺參科（Stichopodidae），是我國(guó)北方沿海重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類(lèi)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值均較高（姜健等，2004；趙鵬等，2013）。除此之外，仿刺參較強(qiáng)的再生能力也是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)（聶竹蘭等，2006），國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其再生的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)過(guò)程進(jìn)行了大量研究（聶竹蘭等，2006；Garcia-arraras et al，2001；李霞等，2007），成果顯著，而對(duì)再生的分子生物學(xué)研究相對(duì)較少，主要集中在對(duì)再生相關(guān)基因的挖掘上（Santiago et al，2000；Zheng et al，2006；陳秋實(shí)等，2008；秦艷杰等，2013；趙祥吉等，2013）。

一般認(rèn)為核糖體蛋白主要負(fù)責(zé)組成核糖體，參與蛋白質(zhì)的合成。近年來(lái)也有研究表面核糖體蛋白還參與細(xì)胞的分裂、增殖、分化、凋亡、發(fā)育調(diào)控等過(guò)程（侯怡鈴等，2010；Vilardell et al，2010）。真核生物約有80種核糖體蛋白，分別組成核糖體的大亞基（RPL）和小亞基（RPS）。核糖體蛋白L17（ribosomal protein L17，RPL17）和L30（ribosomal protein L30，RPL30）都是大亞基的組成部分，位于細(xì)胞質(zhì)中。RPL17和核糖體蛋白L22家族，是核糖體蛋白大亞家族的核心成員。RPL30屬于核糖體蛋白L30e家族成員，是實(shí)現(xiàn)核糖體的裝配以及保證核糖體功能作用發(fā)揮的關(guān)鍵成分，它不僅能獨(dú)立地與RNA相互作用，又能與自身的前體mRNA 5′端前導(dǎo)序列結(jié)合調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)的合成（王艷楓等，2013）。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)顯示很多水產(chǎn)動(dòng)物中已克隆出該基因，但尚未見(jiàn)仿刺參RPL30基因的報(bào)道。關(guān)于RPL30、RPL17基因功能的研究報(bào)道較少，有學(xué)者利用消減差異技術(shù)發(fā)現(xiàn)RPL30基因在肝癌組織中過(guò)表達(dá)（Kondoh et al，2001），并認(rèn)為生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GABP可能是RPL30基因的正調(diào)節(jié)物（Lü et al，2007）。本研究以前期仿刺參體壁再生差減文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中篩選到的一個(gè)高表達(dá)的EST序列（秦艷杰等，2013）為中間序列，采用SMART-RACE法，克隆獲得仿刺參的RPL30基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了RPL30基因在仿刺參各組織中的表達(dá)差異，分析了RPL30和RPL17兩個(gè)核糖體基因在仿刺參再生過(guò)程中的表達(dá)模式。旨在為進(jìn)一步研究核糖體蛋白基因在仿刺參組織發(fā)育、再生修復(fù)及其他生理活動(dòng)中的調(diào)控機(jī)制提供資料。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用刺參取自旅順龍王塘海區(qū)，為1-2齡個(gè)體，麻醉狀態(tài)下體長(zhǎng)為10～14 cm。室溫暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，每天半量換水1次，投喂人工配制餌料。

不同組織的取材：隨機(jī)挑選5頭生長(zhǎng)狀況良好的刺參，分別采集它們的體壁、腸、呼吸樹(shù)、縱肌、體腔細(xì)胞（體腔液3 000 rpm/min離心5 min后收集體腔細(xì)胞），每種組織混合于1個(gè)凍存管中，液氮保存。再生不同階段的取材：取正常健康的刺參45頭，冰上麻醉15~30 min，于其背部無(wú)脊處切取體壁組織約100 μg，形成人工創(chuàng)傷，創(chuàng)傷后正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組：分別取創(chuàng)傷后1~8 d再生出的體壁組織，每個(gè)時(shí)間段各取3頭刺參；對(duì)照組：正常即無(wú)創(chuàng)傷的體壁組織。將取得的體壁組織置于凍存管迅速投入液氮中保存。

1.2總RNA提取及純化

將液氮凍存的正常仿刺參各組織及再生不同階段的體壁組織，采用TRIZOL一步法分別提取總RNA，獲得的總RNA經(jīng)RNase-Free DNase和RNasin Plus RNase Inhibitor處理，再經(jīng)酚氯仿抽提、糖原和醋酸鉀溶液沉淀、乙醇洗滌、0.1% DEPC處理水定容獲得純化的RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。?.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，以28S和18S組分的比率為參考，判斷RNA樣品的降解程度；核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)總RNA的濃度和純度。

1.3引物設(shè)計(jì)

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RPL30基因RACE引物：L303S、L305A1、L305A2和Realtime PCR特異性引物：L30F和L30R，內(nèi)參引物為Cytb F和Cytb R。實(shí)驗(yàn)中所用到引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物序列

1.4 RPL30的cDNA序列克隆

1.4.1 中間序列的獲得

本實(shí)驗(yàn)室先期構(gòu)建了仿刺參體壁再生消減cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)一段長(zhǎng)為253bp的EST序列與核糖體蛋白基因RPL30具有較高同源性。以此序列為中間序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆。

1.4.2 3′RACE擴(kuò)增

3′RACE采用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國(guó)）試劑盒進(jìn)行。3′RACE擴(kuò)增體系（25μL）：ddH2O，13.5μL；10×PCRBuffer，2.5 μL；dNTP，2.0 μL；Mg2+，2.0 μL；3'RACEReady cDNA，1.25 μL；UPM，2.5 μL；L303S，1.0 μL；rTaq酶，0.25μL。3′RACE擴(kuò)增程序：94℃，5 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，2 min；共35個(gè)循環(huán)，72℃，10 min。

1.4.3 5′RACE擴(kuò)增

5′RACE擴(kuò)增也采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國(guó)）試劑盒進(jìn)行。5′RACE1stPCR反應(yīng)體系（25μL）：滅菌水，13.75 μL；10×PCRBuffer，2.5μL；dNTP，2.0μL；Mg2+，2.0μL；5'RACE–Ready cDNA，1.0 μL；UPM，2.5 μL；L305A1，1.0 μL；rTaq酶，0.25 μL。5′RACE 1st PCR反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃，30 s，72℃，2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃，30 s，68℃，30 s，72℃，2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃，30 s，66℃，30 s，72℃，2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃，30 s，64℃，30 s，72℃，2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃，30 s，62℃，30 s，72℃，2 min，25個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。

5′RACE 2nd PCR反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O，13.75 μL；10×PCR Buffer，2.5 μL；dNTP，2.0 μL；Mg2+，2.0 μL；模板（稀釋100倍的1st PCR產(chǎn)物），1.0 μL；NUP，2.5 μL；L305A2，1.0 μL；rTaq酶，0.25μL。5′RACE2ndPCR反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，2 min；共35個(gè)循環(huán)，72℃，10 min。

1.4.4 PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序

分別取5 ul 3′RACE/5′RACE PCR最終產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將獲得的PCR產(chǎn)物回收并與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，菌落PCR檢測(cè)獲得的陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST程序?qū)@得的仿刺參RPL30序列與其他物種進(jìn)行同源性比對(duì)和相似性搜索；ORF Finder軟件確定正確的開(kāi)放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；使用Expasy網(wǎng)站中的Proparam功能（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行氨基酸序列分析；運(yùn)用SOPMA在線(xiàn)工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；用Predict Protein在線(xiàn)工具（https：//www.predictprotein.org/）進(jìn)行蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)；利用Expasy網(wǎng)站中ProtScale在線(xiàn)工具（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行親水性/疏水性分析；利用ClustalX2.0軟件和MEGA4.0軟件采用鄰位相連法（Neighbor-Joining,NJ）在Bootstrap置信值為1 000的條件下構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 Real-timePCR定量分析

1.6.1 cDNA序列的合成

分別取10 μL仿刺參體壁、腸、呼吸樹(shù)、縱肌、體腔細(xì)胞5種組織及體壁再生8個(gè)時(shí)間段的總RNA，按照反應(yīng)體系：PCR Bμffer（5×）4μL，隨機(jī)引物2μL，RT Enzyme 1μL，總RNA 10μL，滅菌水3μL，反應(yīng)程序：42℃60 min，85℃10 min，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.6.2 Real-time PCR反應(yīng)

根據(jù)已獲得的RPL30全長(zhǎng)序列和已報(bào)道的RPL17全長(zhǎng)序列（GenBank NO：JQ922561），設(shè)計(jì)合成Real-time PCR特異性引物L(fēng)30F/L30R和L17F/L17R（表1）和內(nèi)參引物Cytb F/Cytb R（表1）。熒光定量PCR反應(yīng)體系：GreenqPCRMix（2×）10μL，F(xiàn)orward/ReversePrimer（10μM）各0.4μL，ROX0.4μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌水定容至20 μL。反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60/55℃60 s，40個(gè)循環(huán)；之后進(jìn)行融解曲線(xiàn)繪制，反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃30 s，95℃15 s。熒光定量反應(yīng)在StepOnePLUS（ABI,USA）PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，2-△△CT法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1序列分析

最終獲得長(zhǎng)度為557bp的cDNA序列（圖1），已提交到GenBank,登錄號(hào)為JQ770165。該序列包括56bp的5′-UTR，162bp的3′-UTR，開(kāi)放閱讀框339bp，起始密碼子為ATG，編碼氨基酸為甲硫氨酸，終止密碼子為T(mén)AG，共編碼112個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測(cè)該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為12.469 5 Kd，等電點(diǎn)為9.57，總平均親水性為-0.326，定位于細(xì)胞質(zhì)中（RI=1；Expected Accurcy=56%）。除起始密碼子編碼的甲硫氨酸外的111個(gè)氨基酸中，有9個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸（天冬氨酸D和谷氨酸E），17個(gè)帶正電荷的氨基酸（精氨酸R和賴(lài)氨酸K），其余氨基酸為非極性、疏水性氨基酸和極性、中性氨基酸。疏水性分析結(jié)果表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示37個(gè)氨基酸屬于α螺旋，占33.04%，35個(gè)氨基酸屬于延伸鏈，占31.25%，17個(gè)氨基酸屬于β折疊，占15.18%，23個(gè)氨基酸屬于無(wú)規(guī)卷曲，占20.54%。α螺旋和延伸鏈這兩類(lèi)結(jié)構(gòu)元件在RPL30中所占比例較大,而β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。對(duì)核糖體蛋白R(shí)PL30的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)刺參RPL30共有6種功能位點(diǎn)，包括：蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（SKK、SGK、TLK、SLR）4個(gè)；酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)（SEIE）1個(gè)；酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（RKSEIEYY）1個(gè)；N-豆蔻?；稽c(diǎn)（GIKQTL、GTACGK）2個(gè)；核糖體蛋白L30e信號(hào)1位點(diǎn)（SGKYILGIKQTLKSLRQGKAKLIIL）1個(gè)；核糖體蛋白L30e信號(hào)2位點(diǎn)（ELGTACGKYFRVCTLCVTDPG）1個(gè)。

圖1 仿刺參RPL30 cDNA序列和氨基酸序列分析

2.2同源性比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將序列在NCBI上進(jìn)行Blastn比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與其他生物的RPL30基因相似性在75%以上，其中與紫海膽（Strongylocentrotus Purpuratus，XM_778057）的相似性最高為80%，E值為6e-79；與文昌魚(yú)（Branchiostoma belcheri，AF420432）的相似性為79%，E值為6e-66；與黃島長(zhǎng)吻蟲(chóng)（Saccoglossus kowalevskii，XM_002732441）的相似性為78%，E值為1e-67。

Blastx比對(duì)分析結(jié)果顯示該序列與其他生物的RPL30相似性在80%以上，其中與紫海膽（S. purpuratus，XP_783150）的相似性最高為88%，E值為7e-67；與沙蠶（Eurythoe complanata， ABW23229）相似性為83%，E值為4e-61；與非洲爪蟾蜍（Xenopus laevis，NP_001080621）的相似性為83%，E值為4e-61；與斑馬魚(yú)（Danio rerio，NP_956322）的相似性為81%，E值為3e-59；與家鼠（Mus musculus，AAI00609）的相似性為80%，E值為8e-60。

利用NCBI網(wǎng)站的BlastX功能在GenBank中搜尋和篩選到19個(gè)物種（圖2）的RPL30的氨基酸序，應(yīng)用軟件ClustalX2.0、MEGA4.0，采用鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap置信值為1 000。結(jié)果顯示仿刺參與同為棘皮動(dòng)物的紫海膽聚為一支，親緣關(guān)系最近，尾索動(dòng)物海鞘、半索動(dòng)物黃島長(zhǎng)吻蟲(chóng)的聚類(lèi)順序與仿刺參也較近。脊椎動(dòng)物單獨(dú)聚為一支，其中魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物分別各自聚為一個(gè)分支。

2.3 RPL30基因在仿刺參不同組織中的表達(dá)

RPL30基因在仿刺參5種組織中的表達(dá)情況如圖3所示，各組織表達(dá)量在顯著性水平為0.05時(shí)表現(xiàn)為腸>體腔>縱肌>體壁≈呼吸樹(shù)，其中腸、體腔細(xì)胞中的表達(dá)量分別為呼吸樹(shù)的7.24、4.47倍，與呼吸樹(shù)的差異均極顯著（P<0.01），腸與體腔細(xì)胞中的表達(dá)量差異極顯著（P<0.01）；縱肌中表達(dá)量為呼吸樹(shù)的3.12倍，差異顯著（P<0.05）；體壁為呼吸樹(shù)的1.35倍，差異不顯著（P>0.05）。

圖3 仿刺參各組織中RPL30基因的相對(duì)表達(dá)量（以Cytb基因?yàn)閮?nèi)參，標(biāo)注不同字母代表差異顯著）

2.4 RPL30基因在刺參體壁再生不同階段的表達(dá)

RPL30基因在仿刺參再生不同階段的表達(dá)量變化如圖4所示，結(jié)果顯示：仿刺參體壁再生8d過(guò)程中RPL30基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢(shì)，其中僅在第7 d高于對(duì)照組，為對(duì)照組的2.13倍，差異顯著（P<0.05）；其余天數(shù)的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，其中第1、5、6 d的表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.32、0.26和0.16倍，差異均顯著（P< 0.05），第2、3、4、8 d的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.53、0.42、0.54和0.39倍，差異不顯著（P>0.05）。

圖4 仿刺參體壁再生不同時(shí)期RPL30基因的相對(duì)表達(dá)量

2.5 RPL17基因在刺參體壁再生不同階段的表達(dá)

正常和創(chuàng)傷后1-8 d的體壁組織中RPL17基因的表達(dá)變化情況如圖5，結(jié)果顯示：創(chuàng)傷8 d過(guò)程中RPL17基因的表達(dá)量在第2和第5 d時(shí)顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的7.47倍（P<0.01）和5.60倍（P<0.05），且第2 d和第5 d的差異不顯著（P>0.05）；其余第1、3、4、6、7、8 d的表達(dá)量與對(duì)照組之間不存在顯著差異（P>0.05），可見(jiàn)該基因在刺參體壁創(chuàng)傷后第2 d和第5 d分別出現(xiàn)表達(dá)高峰。

圖5 刺參體壁再生不同時(shí)期RPL17基因的相對(duì)表達(dá)量（以Cytb為參照）

圖6 臺(tái)灣島西南反氣旋渦隨時(shí)間演變過(guò)程

3 討論

本研究通過(guò)SMART-RACE法，首次克隆得到仿刺參核糖體蛋白R(shí)PL30基因的全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)已經(jīng)克隆得到的不同物種的RPL30的基因序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從無(wú)脊椎動(dòng)物的軟體動(dòng)物鮑、環(huán)節(jié)動(dòng)物沙蠶、棘皮動(dòng)物海膽、尾索動(dòng)物海鞘到脊椎動(dòng)物魚(yú)類(lèi)斑馬魚(yú)、兩棲類(lèi)非洲爪蟾蜍、哺乳動(dòng)物鼠和人等這樣的進(jìn)化跨度內(nèi)該核糖體蛋白基因均保持有70%以上的同源性，由此可說(shuō)明RPL30基因在生物進(jìn)化中相對(duì)保守，這種高度的遺傳穩(wěn)定性對(duì)維持相關(guān)的功能具有很重要的作用。另外，對(duì)仿刺參、紫海膽、斑馬魚(yú)、非洲爪蟾蜍、人的RPL30二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些物種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成元件基本相同，只是每個(gè)組成元件所占比例不同；蛋白功能位點(diǎn)分析表明紫海膽和人的RPL30蛋白同樣含有6種功能位點(diǎn)，推測(cè)此蛋白功能較為保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，以RPL30為分子進(jìn)化標(biāo)準(zhǔn)得到的物種間親緣關(guān)系與它們?cè)谏飳W(xué)分類(lèi)上的關(guān)系是一致的。

本研究中通過(guò)Real-time PCR分析了RPL30基因在仿刺參中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示RPL30基因在仿刺參各組織中都有表達(dá)，表明該基因?qū)Ψ麓虆⒔M織生長(zhǎng)發(fā)育起到一定的調(diào)控作用。其中，RPL30基因在腸和體腔中的表達(dá)量顯著高于其他組織，推測(cè)這可能與仿刺參自身的組織結(jié)構(gòu)特征相關(guān)。腸組織是仿刺參主要的消化道，含有消化酶在內(nèi)的多種酶類(lèi)，需進(jìn)行大量的物質(zhì)代謝和能量代謝（李霞等，2012），因此該組織的生理活動(dòng)相對(duì)活躍，RPL30基因在腸組織中的表達(dá)量也相對(duì)較高。仿刺參體腔液中存在多種類(lèi)型的體腔細(xì)胞，體腔細(xì)胞的功能類(lèi)似于脊椎動(dòng)物的血細(xì)胞，除參與物質(zhì)運(yùn)輸外，也是仿刺參體內(nèi)主要的免疫防線(xiàn)，體腔細(xì)胞會(huì)通過(guò)包裹、吞噬或釋放具有殺菌作用的細(xì)胞因子的方式對(duì)抗外來(lái)物質(zhì)，由于仿刺參缺乏特異性免疫組織和器官，其免疫系統(tǒng)主要是由細(xì)胞免疫和體液免疫組成的非特異性免疫系統(tǒng)（王淑嫻等，2012），因此為了隨時(shí)抵抗外源細(xì)菌的侵蝕以及完成自身的新陳代謝，體腔中該類(lèi)細(xì)胞通常會(huì)處于增殖活躍期，因此RPL30基因在體腔細(xì)胞中表達(dá)量也較高；體壁、呼吸樹(shù)、縱肌中兩個(gè)基因的表達(dá)量相對(duì)較低，推測(cè)與本研究中所取的仿刺參為健康狀態(tài)良好的成體，未經(jīng)任何生理或人為因素刺激，因此這些組織的結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)穩(wěn)定有關(guān)（王艷楓等，2013）。

本實(shí)驗(yàn)中RPL30基因在再生8 d時(shí)間內(nèi)只有第7 d時(shí)基因的表達(dá)量才顯著高于對(duì)照正常體壁中的表達(dá)量，前6 d的表達(dá)量均低于正常體壁組織中的表達(dá)量。推測(cè)是由于仿刺參在手術(shù)創(chuàng)傷前期出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，手術(shù)創(chuàng)傷后某些致炎因子作用于機(jī)體造成細(xì)胞的損壞，使細(xì)胞顯現(xiàn)變性、壞死，因此前6 d為機(jī)體對(duì)抗炎癥反應(yīng)的階段，此階段損傷細(xì)胞的速度遠(yuǎn)大于細(xì)胞增殖的速度，表現(xiàn)為基因表達(dá)量較正常體壁的表達(dá)量出現(xiàn)下降。第7 d，炎癥反應(yīng)得到控制，細(xì)胞損壞速度下降，細(xì)胞增殖活動(dòng)顯現(xiàn)出來(lái)，因此此時(shí)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)。隨后第8 d表達(dá)量下降，分析出現(xiàn)下降的原因可能是再生過(guò)程是一個(gè)細(xì)胞分化、增殖、遷移的過(guò)程（聶竹蘭等，2006；Garcia-arraras et al.2001；李霞等，2007），再生前期細(xì)胞需要大量增殖來(lái)啟動(dòng)組織的再生，積累到一定量后，RPL30基因可能會(huì)通過(guò)某些信號(hào)途徑阻止細(xì)胞的增殖活動(dòng)（Sara et al，2005；朱可可等，2009），細(xì)胞活動(dòng)開(kāi)始變?yōu)橐赃w移為主，因此再生后期基因的表達(dá)量出現(xiàn)下降。

同為組成核糖體大亞基的RPL17基因在仿刺參中已有克隆和組織表達(dá)的報(bào)道（王艷楓等，2013），本研究中發(fā)現(xiàn)RPL17基因在仿刺參體壁再生過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì)為先上升后下降，再上升再下降，共出現(xiàn)兩個(gè)峰值，再生前8 d的表達(dá)量較之對(duì)照組呈現(xiàn)高表達(dá)的趨勢(shì)。推測(cè)出現(xiàn)第1個(gè)峰值是對(duì)抗創(chuàng)傷刺激的結(jié)果，手術(shù)創(chuàng)傷初期免疫防御系統(tǒng)被激活，核糖體也必須大量合成以保證細(xì)胞增殖的需要，因此創(chuàng)傷后第2 d出現(xiàn)第一個(gè)表達(dá)量峰值。核糖體的生物合成是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，其合成速率受到外界環(huán)境的影響（Kara et al，2006）。目前已知RAS/蛋白激酶A（Toda et al，1987）、TOR（Michael et al，1999）等一些保守的信號(hào)途徑調(diào)節(jié)了核糖體的生物合成速率。核糖體達(dá)到一定量時(shí)，推測(cè)RPL17基因可能會(huì)通過(guò)降低表達(dá)量啟動(dòng)某些信號(hào)途徑，從而阻止核糖體的進(jìn)一步合成，因此RPL17基因的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)第1次峰值后的下降。經(jīng)過(guò)第1個(gè)階段表達(dá)量的變化，刺參適應(yīng)了創(chuàng)傷刺激，體壁開(kāi)始出現(xiàn)再生，RPL17基因又開(kāi)始大量表達(dá)，第5 d時(shí)該基因的表達(dá)量出現(xiàn)第2個(gè)峰值。此后表達(dá)量又開(kāi)始下降，可能是因?yàn)榧?xì)胞增殖積累一定量，細(xì)胞活動(dòng)由增殖變?yōu)殚_(kāi)始遷移，這與體壁再生的組織學(xué)研究結(jié)果（李霞等，2007；Qin et al，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)RPL17和RPL30在仿刺參體壁再生過(guò)程中的表達(dá)存在一定差異，推測(cè)RPL30基因在仿刺參體壁再生過(guò)程中主要參與細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)合成，而RPL17在再生階段的作用可能包括免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖等多種作用。此結(jié)果也說(shuō)明兩個(gè)核糖體基因在刺參的生理活動(dòng)中起著不同的作用，這也從側(cè)面證明核糖體蛋白基因除構(gòu)成核糖體參與蛋白質(zhì)合成外，還有著各自的核糖體外功能。徐存栓的研究（徐存栓等，2008）也發(fā)現(xiàn)肝再生的過(guò)程中核糖體蛋白基因也出現(xiàn)差異表達(dá)；一些特殊的生理狀況如腫瘤中也發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白基因包括RPL30基因差異表達(dá)（王輝等，2007；閆揚(yáng)等，2007），有研究認(rèn)為核糖體蛋白可能是細(xì)胞增生調(diào)節(jié)因子的一個(gè)新家族，通過(guò)作用于細(xì)胞周期的某一點(diǎn)，直接影響腫瘤的發(fā)展（Shriver et al，1998）。因此推斷RPL17、RPL30基因參與了仿刺參的組織生長(zhǎng)以及體壁的再生，但是它們是分別還是協(xié)同調(diào)控仿刺參的再生過(guò)程還有待進(jìn)一步研究。

Garcia-arraras J E,Greenberg M J,2001.Visceral regeneration in holothurians.Microsc Res Tech,55(6):428-451.

Kara A B,Susan J B,2006.Comprehensive mutational analysis of yeast DEXD/H box RNA helicases involved in large ribosomal subunit biogenesis.Molecular and Cellular Biology,26(4):1 195-1 208.

Kondoh N,Shuda M,2001.Enhanced expression of S8,L12,L23a,L27 and L30 ribosomal protein mRNAs in human hepatocelluar carcinoma.Anticancer Res,21:2 429-2 433.

Lü B,Xu J,Zhu Y,2007.Systemic of the differential gene expression profile in a colonic adenoma-normal SSH library.Clin Chim Acat,378: 42-47.

Michael C S,1999.Target of rapamycin(TOR)signaling coordinates tRNA and 5S rRNA gene transcription with growth tRNA and 5S rate in yeast.Gene Therapy And Molecular Biology,4:339-348.

Qin Y,Zhao X,Li X,et al,2015.Characterization of the 26S proteasome S7 subunit gene and tts expression during regeneration in Apostichopus japonicus.Journal of the World Aquaculture Society,46 (2):159-170.

Santiago P,Roig-Lopez J L,Santiago C,et al,2000.Serum amyloid A protein in an echinoderm:Its primary structure and expression during intestinal regeneration in the sea cucumber Holothuriaglaberrima.Exp Zool,288(433):335-344.

Sara A Z,Maria E C,2005.Tor andcyclic AMP-protein kinase A:two parallel pathways regulating expression of genes required for cell growth.Eukaryotic cehull,4(1):63-71.

Shriver S P,Shriver M D,Tirpk D L,1998.Trinucleotide repeat length variation in the human ribosomal protein L14 gene(RPL14):localization to 3p21.3 and loss of heterozygosity in lung and oral cancers.Mulat Res,406:9-23.

Toda T,Cameron S,Sass P,1987.Cloning and characterization of BCY1, a locus encoding a regulatory subunit of the cyclic AMP-dependent protein kinase in Saccharomyces cervisiae.Molecular and Cellular Biology,7(4):1 371-1 377.

Vilardell J,Yu S J,Warner J R,2000.Multiple functions of an evolutionarily conserved RNA binding domain.Mol.Cell,5(4):761-766.

Zheng F X,Sun X Q,Fang B H,et al,2006.Comprarative analysis of genes expressed in regenerating intestine and non-eviscerated intestine of Apostichopus japonicas Selenka(Aspidochirotida:Stichopodidae)and cloning of ependymin gene.Hydrobiologi,571: 109-122.

陳秋實(shí)，李霞，段晶晶，等，2008.利用差異顯示法研究刺參表皮再生相關(guān)基因.生物技術(shù)通報(bào)，6：124-131.

侯怡鈴，侯萬(wàn)儒，2010.大熊貓核糖體蛋白L30亞基基因（RPL30）的cDNA克隆及序列分析.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,47（5）：1 154-1 158.

姜健，楊寶靈，邰陽(yáng)，2004.海參資源及其生物活性物質(zhì)的研究.生物技術(shù)通訊，15（5）：537-538.

李霞，聶竹蘭，魏杰，2007.仿刺參體壁表皮再生組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，14（7）：1-6.

李霞，王雪，秦艷杰，等，2012.仿刺參EGFR基因的克隆與表達(dá)分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，36（1）：41-49.

聶竹蘭，李霞，2006.海參再生的研究.海洋科學(xué)，30（5）：78-82.

秦艷杰，李霞，張慧敏，等，2013.仿刺參體壁創(chuàng)傷修復(fù)消減文庫(kù)的構(gòu)建與分析.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，28（3）：224-229.

王輝，劉偉利，2007.核糖體蛋白基因表達(dá)與腫瘤的關(guān)系.生理科學(xué)進(jìn)展，38（4）：376-378.

王淑嫻，葉海斌，于曉清，等，2012.海參的免疫機(jī)制研究.安徽農(nóng)業(yè)科技，40（25）：12 553-12 555.

王艷楓，李霞，秦艷杰，2013.刺參核糖體蛋白L17基因（RPL17）全長(zhǎng)cDNA克隆及組織表達(dá).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，21（5）：562-569.

徐存栓，楊志利，董華明，2008.核糖體相關(guān)基因在大鼠再生肝及肝腫瘤中表達(dá)異同的表達(dá).解剖學(xué)報(bào)，39（3）：281-286.

閆揚(yáng)，孫秀菊，2007.核糖體蛋白基因家族與腫瘤的關(guān)系.國(guó)際遺傳學(xué)雜志，30（5）：387-390.

趙鵬，楊紅生，孫麗娜，2013.仿刺參（Apostichopus japonicus）攝食和運(yùn)動(dòng)器官的結(jié)構(gòu)與功能.海洋通報(bào)，32（2）：178-183.

趙祥吉，秦艷杰，李霞，等，2013.刺參26S蛋白酶體S7亞基基因的克隆與組織表達(dá)分析.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，28（6）：528-534.

朱可可，易聰，周興濤，2009.核糖體蛋白基因協(xié)同表達(dá)的分子機(jī)制.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，37（35）：17 376-17 379.

（本文編輯：袁澤軼）

Expression of two ribosomal protein genes in body wall regeneration in sea cucumber(Apostichopus japonicus)

QIN Yan-jie1,2,WANG Wen-wen1,WANG Yan-feng2,LI Xia1,2
（1.Key Laboratory of MarineBio-resources Restoration and Habitat Reparation of Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China 2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Dalian Ocean University,Dalian116023,China)

cDNA full-length sequence of ribosomal protein L30(RPL30)gene was cloned in the body wall of sea cucumber(Apostichopus japonicus).In this study,the results showed that the cDNA of RPL30(GenBank accession No. JQ770165)length was 557 bp,including the 56 bp of the 5'-UTR and 162 bp of the 3'-UTR.The open reading frame was 339 bp,encoding polypeptides of 112 amino acids.Real-time PCR was performed to analyze the expression profiling of RPL30.The results showed that the relative expression levels of RPL30 in intestine,coelomocytes,longitudinal muscle,and body wall were 7.24(P<0.01),4.47(P<0.01),3.12(P<0.05)and 1.35(P>0.05)fold of those in the respiratory tree. The expression values of RPL30 gene decreased and then rose during body wall regeneration in A.japonicus,and the peak value,2.13(P<0.05)fold of the control group,occurred at 7d regeneration,and the levels of 1d,5d and 6d were significantly lower than those in the control group.The RPL17 expression level showed two peaks at 2d and 5d regeneration were 7.47(P<0.01)and 5.60(P<0.05)fold of those values in the control group,respectively.The different expressionlevels of RPL17 and RPL30 showed that they would play important,but different roles in the immune response,cell proliferation,protein synthesis and some kinds of regulation.These results would be the necessary basis for mechanism study of protein synthesis,regeneration and other physiological regulation in sea cucumber.

sea cucumber(Apostichopus japonicas);ribosomal protein L30;cloning;ribosomal protein L17;regeneration

S917.4

A

1001-6932（2017）02-0174-08

10.11840/j.issn.1001-6392.2017.02.008

2015-12-25；

2016-02-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（30371099）；遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2007T015）；遼寧省教育廳實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)項(xiàng)（2008S064）。

秦艷杰（1977-），博士，副教授，主要從事海洋生物學(xué)研究。電子郵箱：qinyanjie@dlou.edu.cn。

李霞，碩士，教授。電子郵箱：qin_tina@163.com。