楊瑜 謝貝 吳玲 孟繁榮 王楠 雷杰 張言斌 彭德虎 譚守勇 劉志輝

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·短篇論著·

治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白雙向電泳初步比較分析

楊瑜 謝貝 吳玲 孟繁榮 王楠 雷杰 張言斌 彭德虎 譚守勇 劉志輝

選取2013年于廣州市胸科醫(yī)院治療的初治肺結(jié)核，并經(jīng)1個(gè)常規(guī)抗結(jié)核治療療程(6個(gè)月)治愈的42例患者作為研究對(duì)象，采用雙向凝膠電泳技術(shù)(two dimension electrophoresis，2-DE)對(duì)研究對(duì)象治療前、后的混合血清全組蛋白進(jìn)行電泳分離，以PDQuest 8.0軟件根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)、等電點(diǎn)(isoelectric point，PI)、相對(duì)分子質(zhì)量(relative molecular mass，Mr)等進(jìn)行差異蛋白描述性分析。結(jié)果顯示，研究對(duì)象治療前、后差異蛋白點(diǎn)共有15個(gè)，治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有12個(gè)下調(diào)，3個(gè)上調(diào)，Mr為16 200～76 800，PI為5.0～6.8。由此可見(jiàn)，治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清中存在特異性的差異蛋白，差異蛋白可能作為結(jié)核病的重要診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。

結(jié)核，肺； 血清； 雙向差異凝膠電泳； 蛋白質(zhì)組學(xué)

常規(guī)的結(jié)核病診斷依賴影像、痰涂片和細(xì)菌培養(yǎng)，存在敏感度低、特異度差、耗費(fèi)時(shí)間等問(wèn)題。因此，尋找新的診斷標(biāo)志物，建立敏感可靠的早期診斷方法，以及探討結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制是結(jié)核病防控和治療的首要任務(wù)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，已成為篩選血清標(biāo)志物的有力工具[1]。本研究采用雙向凝膠電泳(two dimension electrophoresis，2-DE)技術(shù)對(duì)42例臨床已治愈的肺結(jié)核患者治療前、后血清標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)比較分析，旨在發(fā)現(xiàn)結(jié)核病相關(guān)的差異蛋白，為肺結(jié)核的早期診斷、發(fā)病機(jī)制探索、病情監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

資料和方法

1.研究對(duì)象：選取2013年于廣州市胸科醫(yī)院治療的初治肺結(jié)核，并經(jīng)1個(gè)常規(guī)抗結(jié)核治療療程(6個(gè)月)治愈的42例患者作為研究對(duì)象，其中男25例，女17例；年齡17～78歲，平均(42.24±18.00)歲。研究對(duì)象均于抗結(jié)核治療前、后分別留取血清，并于廣州市胸科醫(yī)院生物樣本庫(kù)保存。肺結(jié)核臨床治愈的標(biāo)準(zhǔn)為：(1)臨床癥狀好轉(zhuǎn)；(2)痰中抗酸桿菌陰轉(zhuǎn)；(3)胸部X線攝影或CT掃描檢查顯示病灶明顯吸收或病灶穩(wěn)定；(4)空洞閉合或明顯縮小[2]。

2.試劑與儀器：雙向電泳相關(guān)試劑固相pH梯度干膠條(IPG dry strip pH4-7，17 cm)、蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Quick StarTMBradford protein assay)、兩性電解質(zhì)Bio-lyte 3/10、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、考馬斯亮藍(lán)G250染料、碘乙酰胺、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；三氯乙酸(TCA)、丙酮等為常規(guī)有機(jī)試劑。等電聚焦儀(Protean IEF cell)、垂直電泳系統(tǒng)(Protean Ⅱ xi cell)、投射掃描儀GS800和凝膠分析軟件PDQuest 8.0均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

3. 2-DE樣品制備：為了更好地進(jìn)行2-DE凝膠圖片的比較分析，將研究對(duì)象治療前、后血清分別混合成3份電泳標(biāo)本，共計(jì)6份標(biāo)本(每個(gè)標(biāo)本含有14例患者治療前或后的血清)，每個(gè)電泳標(biāo)本加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為10%的冰TCA-丙酮混合液，振蕩混勻，置于冰上4 h；4 ℃，12 000 r/min離心10 min(離心半徑為7 cm)，棄上清，加入1 ml 體積分?jǐn)?shù)為90%的冰丙酮重懸沉淀，離心，去上清，重復(fù)3次；上樣水化液1 ml溶解蛋白樣品。

4.樣品濃度測(cè)定：根據(jù)蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白樣品濃度的測(cè)定。3份混合的患者治療前血清標(biāo)本的蛋白濃度分別為5.15、4.00、6.44 μg/μl；3份混合治療后患者血清標(biāo)本的蛋白濃度分別為5.03、3.39、4.62 μg/μl。

5. 2-DE：(1)第一向電泳于等電聚焦儀上進(jìn)行，3組治療前、后的樣品膠上樣量約為600 μg，水化和聚焦程序設(shè)置為：50 V，12 h，15 ℃(水化)；250 V線性，30 min(除鹽)；1000 V 快速，1 h(除鹽)；10 000 V線性，5 h(升壓)；10 000 V快速，60 000 Vh(聚焦)；500 V快速，任意時(shí)間(保持)。(2)聚焦結(jié)束后，將膠條先后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的DTT和2.5%的碘乙酰胺的膠平衡液中輕搖各10 min。(3)第二向電泳于垂直電泳系統(tǒng)上進(jìn)行，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳[dodecyl sulfate,sodium salt (SDS)-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE]膠濃度為12%，電泳條件為：50 V，30 min；300 V，5 h；每組樣品重復(fù)3次。

6.SDS-PAGE膠染色：采用膠體考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行凝膠染色，具體操作參考文獻(xiàn)[3]。

7.凝膠圖譜分析：應(yīng)用PDQuest 8.0凝膠分析軟件分析治療前、后各份標(biāo)本的蛋白質(zhì)凝膠圖譜，根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)(isoelectric point，PI)、相對(duì)分子質(zhì)量(relative molecular mass，Mr)、匹配度，確定治療前、后差異蛋白點(diǎn)。蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量以灰度值表示，蛋白點(diǎn)表達(dá)量升高或降低3倍以上者則認(rèn)為存在差異。

結(jié) 果

1．2-DE圖譜的建立：通過(guò)上述方法可獲得分辨率和重復(fù)率較高的血清蛋白2-DE圖譜。3組治療前、后混合配對(duì)電泳樣品的匹配率分別為(75±3)%、(77±4)%和(71±4)%；凝膠圖譜中清晰可辨的蛋白點(diǎn)數(shù)為(158±11)個(gè)，Mr分布于12 000～102 000，PI為4.2～6.8，見(jiàn)圖1。

2．差異蛋白分析：治療前與治療后的血清蛋白點(diǎn)比較，第1個(gè)配對(duì)組有24個(gè)差異蛋白點(diǎn)，治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有21個(gè)下調(diào)，3個(gè)上調(diào)；第2個(gè)配對(duì)組有31個(gè)差異蛋白點(diǎn)，治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有28個(gè)下調(diào)，3個(gè)上調(diào)；第3個(gè)配對(duì)組有18個(gè)差異蛋白點(diǎn)，治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有14個(gè)下調(diào)，4個(gè)上調(diào)。綜合分析3個(gè)配對(duì)組治療前后蛋白圖譜，差異蛋白點(diǎn)共有15個(gè)，Mr為16 200～76 800，PI為5.0～6.8，治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有12個(gè)下調(diào)，3個(gè)上調(diào)，見(jiàn)圖1。3組治療前后共有的差異蛋白點(diǎn)具體信息見(jiàn)表1。

圖1、2為第1組患者治療前后血清2-DE圖譜；圖3、4為第2組患者治療前后血清2-DE圖譜；圖5、6為第3組患者治療前后血清2-DE圖譜；箭頭所指為各配對(duì)組治療前、后相對(duì)應(yīng)的差異蛋白點(diǎn)；點(diǎn)1～12為3個(gè)配對(duì)組患者治療后表達(dá)下調(diào)的共有差異蛋白點(diǎn)；點(diǎn)13～15為3個(gè)配對(duì)組患者治療后表達(dá)上調(diào)的共有差異蛋白點(diǎn)圖1 肺結(jié)核治愈患者治療前后血清2-DE圖譜差異分析

討 論

血清是一種理想的生物樣本，易獲取，并且包含大量由病變組織釋放相關(guān)蛋白的生物信息。血清蛋白的快速變化可反映疾病發(fā)展的機(jī)制。因此，在血清或血漿中極有可能尋找到結(jié)核病相關(guān)的重要診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)在血清標(biāo)志物研究上具有很大的優(yōu)勢(shì)[4]。已有學(xué)者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究結(jié)核病患者與正常人血清蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)一些與結(jié)核病相關(guān)的特異性蛋白點(diǎn)。Song等[5]應(yīng)用納米流動(dòng)超高效液相色譜和四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜比較分析結(jié)核病患者與正常人的血清蛋白，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者血清α1-抗胰蛋白酶的表達(dá)較正常人高，是潛在的診斷標(biāo)志物。Li等[6]通過(guò)同位素標(biāo)記差異蛋白分析技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)發(fā)現(xiàn)性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)有可能是結(jié)核病診斷新的標(biāo)志物。同樣應(yīng)用iTRAQ方法，Xu等[7]發(fā)現(xiàn)血清鈣結(jié)合蛋白S100A9、胞外超氧化物歧化酶3(extracellular superoxide dismutase，SOD3)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase，MMP9)可作為肺結(jié)核診斷的新標(biāo)志物，敏感度達(dá)到92.5%，特異度達(dá)到95.0%。由此可見(jiàn)，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在血清中尋找結(jié)核病早期診斷標(biāo)志物是一種必然的趨勢(shì)，而且能為探討結(jié)核病發(fā)病機(jī)制或病情監(jiān)測(cè)提供豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但目前依賴血清標(biāo)志物的簡(jiǎn)便、快速的結(jié)核病診斷方法仍未應(yīng)用于臨床。

表1 肺結(jié)核治愈患者治療前后共有差異蛋白表達(dá)情況

本研究應(yīng)用2-DE技術(shù)將42例治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清分為3組，分析其蛋白差異，差異蛋白點(diǎn)數(shù)分別為24、31和18。組間出現(xiàn)差異蛋白點(diǎn)數(shù)不一致，也許跟各組患者年齡、性別、病情程度，以及不同批次的凝膠電泳條件不同有關(guān)。但本研究通過(guò)隨機(jī)分配及重復(fù)實(shí)驗(yàn)將組間差異降到最低。通過(guò)對(duì)比分析3組樣品的凝膠圖譜，明確患者治療前后存在相同的15個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中，有12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在抗結(jié)核治療后表達(dá)下調(diào)，3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在治療后表達(dá)上調(diào)。肺結(jié)核在抗結(jié)核藥物治療后，體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌活性被抑制或殺滅，對(duì)機(jī)體組織或細(xì)胞產(chǎn)生免疫刺激減少，因此，這也許是治療后部分蛋白表達(dá)下調(diào)的原因。下調(diào)的蛋白點(diǎn)可能為治療肺結(jié)核的重要靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物。而治療后表達(dá)上調(diào)的蛋白或許是細(xì)胞在疾病進(jìn)展過(guò)程中調(diào)節(jié)分泌的重要信號(hào)蛋白，上調(diào)的蛋白點(diǎn)可能為治療結(jié)核病的保護(hù)蛋白或耐藥蛋白。

同時(shí)還發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異蛋白的Mr為16 200～76 800，PI為 5.0～6.8。有的差異蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相同，但PI不同，這種現(xiàn)象反映了這些蛋白有可能來(lái)源于同一前體蛋白，其只是同一前體蛋白通過(guò)不同的修飾作用后而得到的不同產(chǎn)物，而且這些來(lái)源于同一前體蛋白的幾種蛋白有可能共同參與了宿主或結(jié)核分枝桿菌的某一生命活動(dòng)。這跟筆者之前應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)對(duì)16例肺結(jié)核患者治療前后蛋白的研究有相似發(fā)現(xiàn)[8]。

另外，本研究標(biāo)本為治愈的肺結(jié)核患者治療前后的血清，換言之，治愈后的血清即為正常人的血清，因此，本研究不僅明確了肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白的差異，同時(shí)表明肺結(jié)核患者與正常人的血清蛋白存在差異，這與之前的研究結(jié)論相同[9]。

總之，本研究表明肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白凝膠圖譜存在明顯差異。這些差異蛋白點(diǎn)可能為結(jié)核病的重要診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。但本次實(shí)驗(yàn)仍有不足之處，尚未對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，且樣本量少。因此，下一步實(shí)驗(yàn)計(jì)劃將通過(guò)MALDI-TOF-MS或iTRAQ-LC-MS質(zhì)譜技術(shù)，獲取差異蛋白序列，并通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blot)在蛋白水平及通過(guò)RT-PCR在基因水平進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步對(duì)差異蛋白的結(jié)構(gòu)和功能做出評(píng)價(jià)。

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(本文編輯：李敬文)

Preliminary comparative analysis of serum proteins from cured pateints with pulmonary tuberculosis before and after treatment by two dimension electrophoresis

YANGYu,XIEBei,WULing,MENGFan-rong,WANGNan,LEIJie,ZHANGYan-bin,PENGDe-hu,TANShou-yong,LIUZhi-hui.

LungDiseaseInstituteofGuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

Correspondingauthor:LIUZhi-hui,Email:liuyixi2005@163.com

A total of 42 new tuberculosis (TB) cases seeking health care in Guangzhou Chest Hospital in 2013 were enrolled in this study. All the patients were cured after 6-month first-line anti-TB regimen. The two-dimensions electrophoresis (2-DE) was performed to separate the whole blood protein of patients at the initial and end of treatment, respectively. In addition, the isoelectric point (PI) and the relative molecular mass (Mr) were determined by PDQuest 8.0 software. Our results revealed that there were 15 protein spots exhibiting different profiles between these two periods. In addition, the expression levels of 12 protein spots of the post-treatment period were significantly higher than those of the pre-treatment period, while 3 protein spots were significantly decreased after anti-TB treatment. TheMrvalues of these proteins ranged from 16 200-76 800, and the PI values were from 5.0-6.8. On the basis of our findings, there were specific differential serum proteins in the cured tuberculosis patients before and after treatment. The differential proteins might serve as important diagnostic markers or therapeutic targets of TB.

Tuberculosis, pulmonary; Serum; Two-dimensional difference gel electrophoresis; Proteomics

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.023

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014Y2-00117、155700012)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800060)

510095 廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所(楊瑜、謝貝、吳玲、孟繁榮、王楠、雷杰、劉志輝)，結(jié)核內(nèi)科(張言斌、彭德虎、譚守勇)

劉志輝，Email：liuyixi2005@163.com

2016-09-06)