劉文磊，蔣巧艷，洛桑達哇，楊寶良，樊海寧，鄧 勇*，湯 鋒，3**

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.青海省包蟲病重點實驗室，青海 西寧 810001)

藏藥格爾瓊體外殺傷多房棘球蚴藥效作用及活性部位的研究※

劉文磊1，3，蔣巧艷2，洛桑達哇1，3，楊寶良1，3，樊海寧1，3，鄧 勇1，3*，湯 鋒2，3**

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.青海省包蟲病重點實驗室，青海 西寧 810001)

目的 明確藏藥組方格爾瓊體外對抗多房棘球蚴藥效學(xué)活性及其活性部位。方法 將格爾瓊經(jīng)醇提、萃取、凝膠柱層析、硅膠柱層析、液相制備等方法分離純化得到24個不同部位的化合物，將所得化合物以不同的濃度在體外與原頭節(jié)共培養(yǎng)，光鏡下觀察原頭節(jié)死亡率及結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果 空白組原頭節(jié)死亡率為13.67±0.577，格爾瓊醇提物組為93.67±1.523(P<0.0000)，阿苯達唑組為47.67±2.08(P<0.0000)，且格爾瓊醇提物組原頭節(jié)死亡后形態(tài)與阿苯達唑組有明顯差異。繼而對格爾瓊醇提物進行萃取分離，獲得乙酸乙酯部位、正丁醇部位、石油醚部位三個部分，藥效學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位組原頭節(jié)死亡率為93.67±0.577(P<0.0000)。對乙酸乙酯部位進行凝膠柱層析分離，獲得Fraction1、Fraction2、Fraction3、Fraction4、Fraction5五個部位，藥效學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)Fraction3組原頭節(jié)死亡率為97.33±1.528(P<0.0000)。對Fraction3進行硅膠柱層析分離，獲得Fraction3.1、Fraction3.2、Fraction3.3、Fraction3.4、Fraction3.5、Fraction3.6、Fraction3.7、Fraction3.8八個部位，藥物實驗發(fā)現(xiàn)Fraction3.1組原頭節(jié)死亡率為83.00±4.583(P<0.0000)。對Fraction3.1進行液相制備分離，獲得Fraction3.1.1、Fraction3.1.2、Fraction3.1.3、Fraction3.1.4、Fraction3.1.5、Fraction3.1.6、Fraction3.1.7七個部位，藥物實驗發(fā)現(xiàn)Fraction3.1.2組原頭節(jié)死亡率為83.33±3.06(P<0.0000)。結(jié)論 格爾瓊相比阿苯達唑?qū)w外多房棘球蚴具有較強的殺傷作用，其活性組分為大分子非極性化合物。

藏藥 體外培養(yǎng) 多房棘球蚴 藥效活性部位

泡型包蟲病(Alveolar Echinococcosis，AE)又稱多房棘球蚴病，是因多房棘球蚴(Echinococcosis Multilocularis，EM)感染引起的一種人畜共患寄生蟲疾病，它可以向周圍組織浸潤生長并可能向遠處轉(zhuǎn)移[1]，故有“蟲癌”之稱。該病早期無特殊臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，該期的治療手段主要為手術(shù)聯(lián)合化療，療效不理想。目前世界衛(wèi)生組織治療泡型包蟲病的推薦化療藥物為阿苯達唑，但其水溶性差，腸道不易吸收，因而生物利用度不高[2]，且長期持續(xù)治療易導(dǎo)致寄生蟲出現(xiàn)耐藥。本課題組近期研究結(jié)果顯示，高原低氧環(huán)境影響阿苯達唑的體內(nèi)代謝，低氧環(huán)境可影響阿苯達唑代謝關(guān)鍵酶CYP3A4活性，從而導(dǎo)致阿苯達唑有效成分阿苯達唑亞砜代謝減少[3]。因此尋找新的治療泡型包蟲病藥物的研究，對于青海省三江源地區(qū)泡型包蟲病的治療具有十分重要的科學(xué)意義。

格爾瓊為《金珠本草》所記載，由麝香、紅花、丁香、牛黃、唐古特烏頭等15種名貴藥材組成，具有消炎、止痛、祛風(fēng)、補肝益腎、解毒通淋等功效。藏醫(yī)臨床常用于肝萎癥、肝熱癥的治療。藏醫(yī)發(fā)現(xiàn)格爾瓊具有較好的治療棘球蚴病的藥效學(xué)作用，本研究通過有機溶劑提取、凝膠柱層析、硅膠柱層析、液相層析等方法明確藏藥組方格爾瓊體外對抗多房棘球蚴藥效學(xué)活性及其活性部位。

1 材料與方法

1.1 材料

格爾瓊(青海省藏醫(yī)院)，無水乙醇、甲醇(煙臺雙雙化工)，石油醚、正丁醇(天津紅巖)，乙酸乙酯(天津永大)，RPMI-1640(Gibco)，青霉素-鏈霉素混合溶液(Gibco)。

5810R型離心機(Eppendorf)，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器( 上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-IIID 型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)，DHG-9070B鼓風(fēng)干燥箱(上海朗軒實驗設(shè)備有限公司)，DK-2000-IIIL型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，DRT-2N 型電熱套(鄭州大城科工貿(mào)有限公司)，BT224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]，BB150型培養(yǎng)箱(Thermo)，Axio Vert.A1型光學(xué)顯微鏡(蔡司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物提取分離

取干燥的格爾瓊粉末1 kg，加無水乙醇1 L回流提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。浸膏用水混懸，依次用等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次[4]，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，分別減壓濃縮得浸膏。將乙酸乙酯部位10 g用甲醇溶解后進行硅膠柱層析，依次用二氯甲烷：甲醇=98：2、95：5、90：10、50：50、0：100洗脫5個柱體積，分別減壓濃縮得浸膏(Fraction1-5)。將Fraction 3部位(100mg)用10 mL甲醇溶解，過凝膠柱(Sephadex LH-20)，用甲醇洗脫至凝膠柱無顏色，收集濾液，以硅膠薄層色譜指導(dǎo)合并相同組分，共獲取8組成分，分別減壓濃縮得浸膏(Fraction3.1-8)。收集Fraction3.1組分藥物浸膏，用1 mL甲醇溶解，以甲醇-水作流動相，洗脫程序為0～5 min， 5%；5～45 min，5%～75%；45～50 min，75%；50～51 min，75%～100%；平衡10 min。按照高效液相色譜圖收集藥物成分，分別為0～23、23～27、27～35、35～40、40～45、45～50 min，沖柱期7個組分，分別減壓濃縮得浸膏(Fraction3.1.1-7)。

1.2.2 原頭節(jié)的體外培養(yǎng)

從感染泡球蚴的沙鼠腹腔中，在無菌條件下采集含原頭節(jié)的囊塊，在PBS(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL鏈霉素，pH7.2～7.4)中剪碎后，用四層紗布過濾，室溫下沉淀數(shù)分鐘，用PBS(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL鏈霉素，pH7.2～7.4)清洗數(shù)次。鏡下觀察活原頭節(jié)占95%以上，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL鏈霉素，pH7.2～7.4)稀釋至10%(體積)，置培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。

1.2.3 藥物活性測定

取格爾瓊醇提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、Fraction1-5部位、Fraction3.1-8部位適量，用DMSO促溶，含10%體積原頭節(jié)的RPMI-1640培養(yǎng)基分別稀釋至200、20、20、20、1 mg/mL和200 μg/mL，使DMSO終濃度為0.1%[5]，培養(yǎng)于6孔板中，每組3個復(fù)孔。取300 μg Fraction3.1部位制備液相，收集不同組分，減壓濃縮后用甲醇溶解，置于6孔板中，待甲醇揮發(fā)后用DMSO助溶，加入3 mL10%體積的原頭節(jié)懸液，使DMSO終濃度為0.1%[5]，每組設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)置3個DMSO濃度為0.1%的孔為空白對照，在培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)144 h。用原頭節(jié)溶液與0.4%臺盼藍溶液混合(9：1體積)染色，普通光鏡下觀察。判斷原則：死亡原頭節(jié)藍染且無活動性，活頭節(jié)拒染，不著色且有活動性。隨機挑選視野計數(shù)100個原頭節(jié)中著色原頭節(jié)數(shù)目，以著色者占原頭節(jié)的比例為原頭節(jié)死亡率，共計數(shù)3次，計算平均死亡率[6]。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用單因素t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 格爾瓊醇提物組及其不同極性部位組的藥效學(xué)實驗

a：格爾瓊醇提部位萃取圖，b：格爾瓊醇提組，c：乙酸乙酯部位組，d：阿苯達唑組，e：空白組，f：正丁醇部位組，g：石油醚部位組.

圖中表示死亡原頭節(jié)圖中表示結(jié)構(gòu)遭到破壞的原頭節(jié)

圖1 格爾瓊醇提部位分離純化步驟圖及阿苯達唑組原頭節(jié)、格爾瓊醇提物組、醇提物的不同極性部位組結(jié)構(gòu)圖
Figure 1 Structure of protoscolextreated with albendazole，ethanol extraction and different polar partsof ethanol extraction

將格爾瓊醇提物水溶后依次用相同體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇極性萃取得石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位三個部位(圖1a)。將10%體積的原頭節(jié)分別與200 mg/mL格爾瓊醇提物、20 mg/mL乙酸乙酯部位、20 mg/mL石油醚部位、20 mg/mL正丁醇部位及阿苯達唑(2μg/mL)共培養(yǎng)144 h。原頭節(jié)溶液與0.4%臺盼藍溶液混合(9：1體積)染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)格爾瓊醇提物組、乙酸乙酯部位組原頭節(jié)多數(shù)被臺盼藍深染，深染原頭節(jié)輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整(圖1b～c)，阿苯達唑組原頭節(jié)少數(shù)被臺盼藍深染(圖1d)。格爾瓊正丁醇部位組原頭節(jié)、石油醚部位組原頭節(jié)與空白組原頭節(jié)結(jié)構(gòu)無明顯差異(圖1e～f)。

培養(yǎng)后原頭節(jié)臺盼藍染色，光鏡下計數(shù)，空白組原頭節(jié)死亡率為13.67±0.58，格爾瓊醇提物組為93.67±1.53(P<0.0000 V.S.Con組)、乙酸乙酯部位組為93.67±0.58(P<0.0000 V.S.Con組)、阿苯達唑組為47.67±2.08(P<0.0000 V.S.Con組)、格爾瓊石油醚部位組為13.67±2.52(P=0.7149V.S.Con組)、格爾瓊正丁醇部位組為15.67±2.31(P=0.4512 V.S.Con組)(圖2)。

**：與空白組相比P<0.01，##：與阿苯達唑組相比P<0.01.

圖2 阿苯達唑組、格爾瓊醇提組及其不同極性部位組原頭節(jié)死亡率圖
Figure 2 Themortality rate of protoscolex treated with albendazole，ethanol extraction and different polar partsofethanol extraction

2.2 Fraction1-5的藥效學(xué)實驗

將乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析分離純化后獲得Fraction1-5(圖3a)，將10%體積的原頭節(jié)分別與1 mg/mL Fraction1-5共培養(yǎng)144 h后用臺盼藍染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Fraction3組原頭節(jié)多數(shù)被臺盼藍深染，與格爾瓊醇提物組原頭節(jié)死亡后形態(tài)相似(圖3d)。而其余部位組原頭節(jié)形態(tài)與空白對照組原頭節(jié)形態(tài)無明顯差異(圖3b、c、e、f)。

a：乙酸乙酯部位硅膠柱層析圖，b：Fraction 1組，c：Fraction 2組，d：Fraction 3組，e：Fraction 4組，f：Fraction5組，g：control組.

圖中代表死亡原頭節(jié)

圖3 Fraction1-5部位組原頭節(jié)結(jié)構(gòu)圖
Figure 3 Structure of protoscolex treated withFraction1-5

將培養(yǎng)后原頭節(jié)用臺盼藍染色，光鏡下計數(shù)，空白組原頭節(jié)死亡率為18.33±1.53，F(xiàn)raction 3組為97.33±1.53(P=0.0001V.S.Con組)，F(xiàn)raction2組為35.33±1.53(P=0.0002 V.S.Con組)，F(xiàn)raction4組為26.67±5.13(P=0.0543 V.S.Con組)，F(xiàn)raction5組為26.00±2.65(P=0.0122 V.S.Con組)；Fraction1組為18.33±1.53(P>0.999 V.S.Con組)(圖4)。

**：與空白組相比P<0.01.

圖4 Fraction1-5部位組原頭節(jié)死亡率圖
Figure 4 Mortality rate of protoscolex treated with Fraction1-5

2.3 Fraction 3.1-8的藥效學(xué)實驗

將Fraction3進行凝膠柱層析分離純化，并利用硅膠薄層色譜指導(dǎo)合并相同組分，得到Fraction3.1-8(圖5a)。將10%體積的原頭節(jié)分別與200 μg/mL Fraction3.1-8共培養(yǎng)144 h，用臺盼藍染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Fraction3.1組原頭節(jié)多數(shù)被臺盼藍深染，形態(tài)與格爾瓊醇提物組原頭節(jié)死亡后形態(tài)相似(圖5b)。而其余部位組原頭節(jié)形態(tài)與空白組原頭節(jié)形態(tài)無明顯差異(圖5 c～h)。

a：Fraction3部位凝膠柱層析圖，b：Fraction3.1組，c：Fraction3.2組，d：Fraction3.3組，e：Fraction3.4組， f：Fraction3.5組，g：Fraction3.6組，h：Fraction3.7組，i：Fraction3.8組.

圖中代表死亡原頭節(jié)

圖5 Fraction3.1-8組原頭節(jié)結(jié)構(gòu)圖
Figure 5 Structure of protoscolex treated with Fraction3.1-8

培養(yǎng)后原頭節(jié)臺盼藍染色，光鏡下計數(shù)，空白組原頭節(jié)死亡率為19.33±0.58，F(xiàn)raction3.1組為83.00±4.589(P=0.0001V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.3組為32.00±7.00(P=0.0354 V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.4組為30.33±2.89(P=0.0029 V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.5組為52.00±5.20(P=0.0004 V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.2組為22.33±4.04(P=0.2720 V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.6組為26.33±0.58(P=0.0001 V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.7組為28.00±5.00(P=0.0406V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.8組為23.67±2.89(P=0.0122V.S.Con組)(圖6)。

**：與空白組相比P<0.01.

圖6 Fraction3.1-8組原頭節(jié)死亡率圖
Figure 6 Mortality rate of protoscolex treated with Fraction3.1-8

2.4 Fraction3.1.1-7的藥效學(xué)實驗

將Fraction3.1利用制備液相的方法進行分離，獲得Fraction3.1.1-7(圖7a)，將10%體積的原頭節(jié)分別與Fraction3.1.1-7共培養(yǎng)144 h，臺盼藍染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Fraction3.1.2組原頭節(jié)多數(shù)被臺盼藍深染，形態(tài)與格爾瓊醇提物組原頭節(jié)形態(tài)相似(圖7c)。而其余部位組原頭節(jié)形態(tài)與空白組原頭節(jié)形態(tài)無明顯差異(圖7b、d、e、f、g、h)。

a：制備液相圖，b：Fraction3.1.1組，c：Fraction3.1.2組，d：Fraction3.1.3組，e：Fraction3.1.4組，f：Fraction3.1.5組， g：Fraction3.1.6組，h：Fraction3.1.7組，i：control組.

圖中表示死亡原頭節(jié)

圖7 Fraction3.1.1-7部位藥物實驗原頭節(jié)結(jié)構(gòu)圖
Figure 7 Structure of protoscolex treated with Fraction3.1.1-7

培養(yǎng)后原頭節(jié)臺盼藍染色，光鏡下計數(shù)，空白組原頭節(jié)死亡率為14.67±1.15，F(xiàn)raction3.1.2組為83.33±3.05(P<0.0001V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.1.3組為24.67±1.15(P=0.0004V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.1.5組為25.33±1.15(P=0.0003V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.1.6組為27.33±1.53(P=0.0003V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.1.1組為17.33±1.53(P=0.0734V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.1.4組為19.00±3.46(P=0.1090V.S.Con組)，F(xiàn)raction3.1.7組為15.33±1.15(P=0.5185V.S.Con組)(圖8)。

**：與空白組相比P<0.01.

圖8 Fraction3.1.1-7部位藥物實驗原頭節(jié)死亡率圖
Figure 8 Mortality rate of protoscolex treated with Fraction3.1.1-7

3 討論

體外培養(yǎng)模型是研究寄生蟲與宿主之間相互作用機制必不可少的工具，為評估抗棘球蚴藥物提供了實驗材料[7]。體內(nèi)泡球蚴生長分化受宿主-寄生蟲之間相互作用等因素影響，不易進行實驗研究，體外模型為分析和探討藥物對寄生蟲的影響提供了可能，對尋找新的治療棘球蚴病藥物提供了方法和途徑[8-12]。此外，體外培養(yǎng)比動物實驗安全而且實驗周期短[13]。本實驗以體外培養(yǎng)的泡球蚴為材料進行體外藥物活性部位篩選實驗。實驗中各組原頭節(jié)死亡率間存在差異，可能的原因是：1.藥物分離純化過程中必定造成成分丟失，同時可能存在不同成分間的協(xié)同作用；2.不同實驗組間藥物成分不同，其中含有有效成分濃度可能不同，未達到殺滅原頭節(jié)的最適濃度；3.不同實驗組間原頭節(jié)活性存在差異，本次實驗原頭節(jié)來源均為接種于沙鼠腹腔內(nèi)的原頭節(jié)，宿主間體質(zhì)及免疫狀態(tài)等內(nèi)環(huán)境的不同均可能對原頭節(jié)活性造成影響。

有研究證明[14]，術(shù)前加用藏藥占皎達色能夠減少包蟲病術(shù)后并發(fā)癥，緩解臨床癥狀，提高治愈率。陳欽銘[15]等證明，紫堇的提取液作用于細粒棘球蚴后可使棘球蚴生長發(fā)育受阻?？到痫L(fēng)[16]等證明，駱駝蓬籽提取液可以明顯抑制體內(nèi)棘球蚴和泡球蚴的生長，包根書[17]等研究顯示，砂生槐提取物有抑制小鼠體內(nèi)棘球蚴生長的作用。格爾瓊是藏醫(yī)典《金珠本草》中記載的抗包蟲藥物，其中含有麝香、紅花、丁香、牛黃、唐古特烏頭、犀角、朱砂、紫檀香、大托葉云實、木香、訶子、毛訶子、余甘子、黑草烏、藏菖蒲等名貴中草藥。丁香對流感病毒及痢疾桿菌有明顯的抑制作用，同時丁香具有較強的殺蟲作用[18]。麝香具有強氧化性，對各種細菌的生長具有明顯的抑制作用，也能促進免疫器官胸腺和脾臟的發(fā)育，增強細胞免疫和體液免疫，促進肝臟中SOD的活性的作用[19]。紅花能夠提高小鼠的非特異性免疫和細胞免疫功能，增強單核細胞吞噬功能[20]，同時具有保肝的生物活性[21]。牛黃有很好的保肝利膽的作用[22]。唐古特烏頭藏醫(yī)臨床上主要用于黃疸型肝炎的治療[23]。同時，訶子、毛訶子、余甘子、黑草烏均具有保肝、利膽的功效，犀角有解毒的功效。

藏醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)格爾瓊具有較好的治療棘球蚴病的藥效學(xué)作用。本研究證實了藏藥格爾瓊體外殺傷多房棘球蚴藥效作用并對其活性部位進行分離純化，初步確定了格爾瓊活性部位。

回流提取法所得到的提取液常為混合物，需進一步分離精制，因而在確定格爾瓊醇提物對原頭節(jié)有殺傷作用后，又進一步采用溶劑萃取法分離此部位。本實驗采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三部位分離法進行了部位分離，使其中化合物被分離成脂溶性成分、親脂性單糖苷類和大分子苷元，以及多數(shù)苷類和有機酸等。對各提取部位藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯部位化合物對體外原頭節(jié)具有較強的殺傷作用，且其殺傷后原頭節(jié)結(jié)構(gòu)與格爾瓊醇提物殺傷后原頭節(jié)結(jié)構(gòu)相似，對該部位進一步根據(jù)極性利用硅膠柱層析進行了分離，對各提取部位藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中等極性部位化合物對體外原頭節(jié)具有較強的殺傷作用，進一步對該部位化合物根據(jù)分子量大小不同利用凝膠層析進行了分離，對各提取部位藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，分子量大的化合物對體外原頭節(jié)具有較強的殺傷作用，提示格爾瓊中對體外原頭節(jié)具有殺傷作用的化合物可能是大分子，屬中等極性化合物。

格爾瓊與阿苯達唑作用后的體外原頭節(jié)結(jié)構(gòu)改變不同，格爾瓊作用后的原頭節(jié)死亡后保存有完整的結(jié)構(gòu)，而阿苯達唑作用后的原頭節(jié)多皺縮，這提示兩者對原頭節(jié)殺傷作用的機制可能不同。目前的研究結(jié)果只能說明本實驗條件下組分與阿苯達唑在體外對原頭節(jié)均有殺傷作用，但其活性物質(zhì)的具體成分，是否存在不同部位的協(xié)同作用及其作用機制仍待進一步闡明。

[1]Kawamura N，Kamiyama T，Sato N，et al.Long-term results of hepatectomy for patients with alveolar echinococcosis：a single-center experience[J].Journal of the American College of Surgeons，2011，212(5)：804-812.

[2]Chai J，Jiao W，Sun D，et al.Clinical efficacy of albendazole emulsion in treatment of 212 cases of liver cystic hydatidosis[J].Chinese medical journal，2002，115(12)：1809-1813.

[3]萬陳飛.低氧條件下阿苯達唑藥代動力學(xué)的研究[D].青海大學(xué)，2016.

[4]李靜，王集會，潘少斌，等.忍冬(Lonicera japonic Thunb.)果實抑菌活性及化學(xué)成分研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，34(1)：85-90.

[5]于春洋，商少華，張瑞妮，等.3種助溶劑對阿苯達唑和阿苯達唑亞砜體外抗包蟲活性的影響[J].中國病原生物學(xué)雜志，2013，8(7)：620-623.

[6]包永星，毛睿，齊洪志，等.X線照射泡球蚴原頭節(jié)的體外實驗研究[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2011，29(3)：208-211.

[7]Zhang Y L，Wang T T，Zhou X T，et al.In vitro cultivation of Echinococcus multilocularis metacestodes and observation of their growth[J].Zhongguo ji sheng chong xue yu ji sheng chong bing za zhi=Chinese journal of parasitology & parasitic diseases，2007，25(2)：93-96.

[8]Jura H，Bader A，F(xiàn)rosch M.In Vitro Activities of Benzimidazoles against Echinococcus multilocularis Metacestodes[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，1998，42(5)：1052-1056.

[9]Ingold K，Bigler P，Thormann W，et al.Efficacies of albendazole sulfoxide and albendazole sulfone against in vitro-cultivated Echinococcus multilocularis metacestodes[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1999，43(5)：1052-1061.

[10]Reuter S，Merkle M，Brehm K，et al.Effect of amphotericin B on larval growth of Echinococcus multilocularis[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2003，47(2)：620-625.

[11]Reuter S，Buck A，Grebe O，et al.Salvage treatment with amphotericin B in progressive human alveolar echinococcosis[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2003，47(11)：3586-3591.

[12]Jura H，Bader A，Hartmann M，et al.Hepatic tissue culture model for study of host-parasite interactions in alveolar echinococcosis[J].Infection and immunity，1996，64(9)：3484-3490.

[13]萬瑪侃卓，李先加.術(shù)前加用藏藥占皎達色配合治療肝包蟲病，中國民族醫(yī)藥雜志，2001，1，19.

[14]李瓊毅，陳根，包根書，等.泡球蚴組織的體外培養(yǎng)及在藥物篩選中的應(yīng)用[J].中國病原生物學(xué)雜志，2006，1(4)：263-265.

[15]陳欽銘，葉于聰，許子俊，等.藏藥紫堇對細粒棘球蚴作用的掃描電子顯微鏡觀察[J].青海醫(yī)藥雜志，1985，75(2)：1-3.

[16]康金風(fēng)，楊文光.駱駝蓬籽治療小鼠腹腔棘球蚴和泡球蚴的效果[J].新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1993，16(3)：178-181.

[17]包根書，史大中，馬興銘.砂生槐生物堿抗小鼠細粒棘球蚴作用的初步觀察[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2005，23(6)：471-472.

[18]郭梅珍.試探丁香與郁金的合用及單用[J].中醫(yī)學(xué)報，2013，28(3)：394-395.

[19]陳玉山，趙偉剛.麝鼠香抗衰老活性的研究[J].特產(chǎn)研究，2005，27(2)：5-7.

[20]王曉菲，金鳴.紅花抗炎作用機制研究進展[J].山西醫(yī)藥雜志，2007，36(1)：51-53.

[21]扈曉佳，殷莎，袁婷婷，等.紅花的化學(xué)成分及其藥理活性研究進展[J].藥學(xué)實踐雜志，2013，31(3)：161-168.

[22]薛小平，李東華，劉錚，等.活血化瘀中藥對清熱利膽中藥利膽作用的增效研究[J].天津中醫(yī)藥，2006，23(1)：70-72.

[23]張義智，常建暉，邵成雷，等.唐古特烏頭研究進展[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2012，18(1)：70-73.

Study on the Pharmacodynamics and Active Site of Geerqiong killing Protoscolexin in vitro

LIU Wen-lei1，3，JIANG Qiao-yan2，LUOSANG Da-wa1，3，YANG Bao-liang1，3， FAN Hai-ning1，3，DENG Yong1，3*，TANG Feng2**

(1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai，Xining 810001； 2.Research Center for High Altitude Medical Sciences，Qinghai University，Qinghai，Xining 810001； 3.Key Lab. for hydatid diseases of Qinghai Province，Xining，Qinghai 810001)

Objective To elucidate the pharmacodynamics and active site of Tibetan medicinal herbGeerqiong on the effect of killing protoscolexin vitro.Methods Twenty-six compounds were isolated and purified by alcohol extraction，gel column chromatography，silica gel column chromatography and preparative liquid phase.The protoscolex was treated with different concentrations of compounds in vitro.Observe the mortality and structural changes of the protoscolex under light microscope.Result The mortality rate of protoscolex in control group was 13.67±0.577 and ethanol extract group was 93.67±1.523(P<0.0000)，ABZ group was 47.67±2.08(P<0.0000)，respectively.The structure changes of protoscolex treated with ABZ and ethanol extract was significantly different.Three parts were obtained from the extraction of alcohol extract which named ethyl acetate part，n-butanol part and petroleum etherpart.We found that the mortality rate of protoscolex treated with ethyl acetate part was 93.67±0.577(P<0.0000).Fraction1，F(xiàn)raction2，F(xiàn)raction3，F(xiàn)raction4，F(xiàn)raction5 were obtained from the ethyl acetate site with gel column chromatography.The pharmaceutic active experiment found that the mortality rate of protoscolex treated with Fraction3 was 97.33±1.528(P<0.0000).(4)Fraction3.1，F(xiàn)raction3.2，F(xiàn)raction3.3，F(xiàn)raction3.4，F(xiàn)raction3.5，F(xiàn)raction3.6，F(xiàn)raction3.7，F(xiàn)raction3.8 were obtained from Fraction3 with Silica gel column chromatography.The pharmaceutic active experiment found that the mortality rate of protoscolex treated with Fraction3.1 was 83.00±4.583(P<0.0000).(5)Fraction3.1.1，F(xiàn)raction3.1.2，F(xiàn)raction3.1.3，F(xiàn)raction3.1.4，F(xiàn)raction3.1.5，F(xiàn)raction3.1.6，F(xiàn)raction3.1.7 were obtained from Fraction3.1 with S liquid phase.The pharmaceutic active experiment found that the mortality rate of protoscolex treated with Fraction3.1 was 83.33±3.06(P<0.000).Conclusion Geerqiong has a stronger effect on protoscolex compared with albendazole in vitroand its active site is macro-molecular non-polar compound.

Tibetan medicinein In vitro Echinococcosis Multilocularis Pharmacodynamics active fraction

*：通信作者，主任醫(yī)師、碩士生導(dǎo)師，E-mial：dengyong@medmail.com.cn；**：通信作者，博士，E-mial：leileitang1984@163.com 劉文磊(1988～)，男，漢族，山東籍，青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰二科在讀研究生

R917

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.011

2017-02-19

※：青海省重大科技專項(2016-SF-A5).