胡恩澤，魏 明，黃正輝#（1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院/武漢市第六醫(yī)院西藥劑科，武漢 430015；.武漢市醫(yī)療救治中心結(jié)核科，武漢 43003）

加速溶劑萃取-離子色譜法同時測定黃連上清片中9種常見無機陰離子的含量

胡恩澤1＊，魏 明2，黃正輝2#（1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院/武漢市第六醫(yī)院西藥劑科，武漢 430015；2.武漢市醫(yī)療救治中心結(jié)核科，武漢 430023）

目的：建立同時測定黃連上清片中9種常見無機陰離子含量的方法。方法：采用加速溶劑萃取-離子色譜法。陰離子交換分析柱為Ion Pac AS11-HC，保護柱為Ion Pac AG11-HC，淋洗液為氫氧化鉀溶液（梯度洗脫），流速為1.2 mL/min，洗脫時間為18 min，柱溫為30 ，進樣體積為25 μL。結(jié)果：氟離子、甲酸根離子、氯離子、亞硝酸根離子、溴離子、硝酸根離子、硫酸根離子、草酸根離子和磷酸根離子檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為0.1～5 mg/L（r為0.999 0～0.999 9）；定量限分別為0.020、0.078、0.030、0.058、0.052、0.068、0.084、0.064、0.074 mg/L，檢測限分別為0.005、0.024、0.008、0.017、0.015、0.022、0.026、0.020、0.021 mg/L；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜4.0%；加樣回收率為80.00%～125.08%（RSD為0.97%～2.47%）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于黃連上清片中9種常見無機陰離子含量的同時測定。

加速溶劑萃??；離子色譜法；黃連上清片；無機陰離子

黃連上清片收載于2015年版《中國藥典》（一部），主要由大黃、黃連、黃柏、黃芩、白芷、梔子、桔梗等17味中藥材組成[1]，具有清熱通便、散風(fēng)止痛的作用，主要用于治療風(fēng)熱上攻、頭暈?zāi)垦?、牙齒疼痛、口舌生瘡、咽喉腫痛和大便秘結(jié)等癥狀[2-3]。根據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明，中藥復(fù)方制劑中含多味中藥，化學(xué)成分復(fù)雜，藥效是其多種有效成分共同作用的結(jié)果，而有效成分不僅包括有機成分，還包括無機離子成分[4]。因此，中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制應(yīng)該包括有機成分和無機成分。目前，2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定了應(yīng)用薄層色譜法鑒定大黃素、小檗堿、梔子苷，以控制黃連上清片的質(zhì)量[1]。再者，有不少文獻報道了黃連上清片中的相關(guān)有機成分質(zhì)量控制的研究[5-8]。但截止目前，尚未有文獻報道控制黃連上清片中陰陽離子等無機成分的含量。氟（F）、氯（Cl）、磷（P）、氮（N）是人體必不可少的元素，對人體的骨骼、牙齒和機體酸堿平衡起著重要作用[9]。硝酸根離子（NO2－）、硫酸根離子（SO42－）和草酸根離子（C2O42－）等常見的陰離子含量過高對人體健康有一定的影響[10]。離子色譜法具有簡便、快速、靈敏度高、干擾少等特點，能實現(xiàn)多組分同時定量分離，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥、生命科學(xué)和食品等領(lǐng)域[11-12]。再者，加速溶劑萃取法是在高溫高壓下通過溶劑提取樣品成分，提高目標成分溶解度的方法，具有耗時少，溶劑用量少，提取效率高等優(yōu)勢。中藥復(fù)方制劑機制復(fù)雜，各種離子含量差異比較大。為了更加全面的控制黃連上清片的質(zhì)量，筆者采用加速溶劑萃取-離子色譜法測定了黃連上清片中9種常見無機陰離子的含量。

1 材料

1.1 儀器

ASE350型加速溶劑萃取儀、ICS-900 RFC30型離子色譜儀，包括ASRS 300（4 mm）抑制器，CD電導(dǎo)檢測器（美國Dionex公司）；BS224S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；TDZ4-WS型離心機（長沙市平凡儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黃連上清片（江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司，批號：20160305，規(guī)格：0.3 g/片）；氟離子（F－）、甲酸根離子（COO－）、氯離子（Cl－）、亞硝酸根離子（NO2－）、溴離子（Br－）、NO3－、SO42－、C2O42－和磷酸根離子（PO43－）標準品溶液（中國計量科學(xué)研究院，批號分別為B1627013、B1627013、B1627015、B1627013、B1627030、B1622014、B1622015、B1622015、B1622015，質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L）；氫氧化鉀溶液為離子色譜儀自動產(chǎn)生，水為超純水（電阻率＞18.2 MΩ·cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：陰離子交換分析柱Ion Pac AS11-HC（250 mm×4 mm，4μm）、保護柱Ion Pac AG11-HC（50 mm×4 mm，4μm）；淋洗液：氫氧化鉀溶液，梯度洗脫（0～2.5 min，5 mmol/L；2.5～3 min，5→35 mmol/L；5～13 min，35 mmol/L；13～14 min，35→5 mmol/L；14～18 min，5 mmol/L）；流速：1.2 mL/min；洗脫時間：18 min；柱溫：30 ；進樣量：25 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合標準品溶液 分別準確量取各待測無機陰離子標準品溶液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加0.1%氫氧化鉀溶液定容，得F－、COO－、Cl－、NO2－、Br－、NO3－、SO42－、C2O42－和PO43－質(zhì)量濃度均為100 mg/L的混合標準品貯備液。分別準確量取上述混合標準品貯備液0.010、0.020、0.050、0.10、0.20、0.50 mL，置于同一10 mL量瓶中，加0.1%氫氧化鉀溶液定容，制成系列混合標準品溶液（0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L）。準確移取SO42－標準品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加0.1%氫氧化鉀溶液定容，得SO42－質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準品貯備液。準確量取上述SO42－標準品貯備液0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加0.1%氫氧化鉀溶液定容，制成系列SO42－標準品溶液（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L）。

2.2.2 供試品溶液 將樣品研磨至粉末后混合均勻，準確稱取樣品粉末50 mg，置于萃取池中（萃取溫度：40 ；萃取壓力：1 600 psi；萃取溶劑：20 mL 0.1%氫氧化鉀溶液，靜態(tài)循環(huán)10 min，循環(huán)3次；沖洗體積：10 mL，沖洗時間：30 s）處理，萃取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，充分搖勻，以半徑為6 cm、3 500 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合標準品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，9種無機陰離子成分分離度＞1.5，各成分分離良好，不受雜質(zhì)影響。

圖1 離子色譜圖Fig 1 Ion chromatography

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下系列混合標準品溶液各25 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測無機陰離子質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下系列混合標準品溶液各適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表1。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合標準品溶液（1.00 mg/L）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，F(xiàn)－、COO－、Cl－、NO2－、Br－、NO3－、SO42－、C2O42－和PO43－峰面積的RSD分別為1.1%、1.5%、1.2%、0.9%、0.5%、1.6%、1.9%、1.4%、1.6%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表1 回歸方程、線性范圍、定量限與檢測限Tab 1 Regression equation，linear range，the limits of quantitation and detection

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20160305）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，F(xiàn)－、COO－、Cl－、NO2－、Br－、NO3－、SO42－、C2O42－和PO43－峰面積的RSD分別為1.6%、1.8%、2.2%、1.4%、2.8%、3.5%、1.8%、2.4%、1.7%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20160305）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，F(xiàn)－、COO－、Cl－、NO2－、Br－、NO3－、SO42－、C2O42－和PO43－峰面積的RSD分別為1.8%、1.4%、2.1%、1.7%、1.3%、2.8%、

2.4 %、1.2%、1.6%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：20160305）適量，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的各待測無機陰離子標準品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品中無機陰離子含量測定

取樣品適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3（表中“-”為未檢出）。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

Ion Pac AS11-HC陰離子交換分析柱是烷醇季銨基團的中高親水性色譜柱，對水溶液中的陰離子分離能力良好，柱容量高，適合復(fù)雜基體中低質(zhì)量濃度陰離子的分離。因此，本試驗選擇Ion Pac AS11-HC陰離子交換分析柱分離9種無機陰離子。由于中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，測定離子種類較多，采用等度洗脫無法實現(xiàn)每個陰離子的良好分離，同時不能較好地排除雜質(zhì)峰的干擾，因此采用梯度洗脫。在離子色譜法中，用于分離水溶液中陰離子的淋洗液一般為氫氧化納溶液或氫氧化鉀溶液；考慮到儀器兼容性的問題，本試驗采用氫氧化鉀溶液作為淋洗液。梯度淋洗液是由儀器淋洗液自動發(fā)生系統(tǒng)產(chǎn)生，因此儀器的梯度淋洗基線平穩(wěn)，重現(xiàn)性好。在優(yōu)化梯度淋洗條件下，筆者分別考察了淋洗液強度、淋洗時間長度和淋洗速度。結(jié)果表明，淋洗強度和淋洗時間長度對陰離子的分離度影響最為顯著，淋洗速度主要影響分析時間長短。試驗過程發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)－和COO－在Ion Pac AS11-HC陰離子交換分析柱的保留行為比較接近，同時相對其他的陰離子，保留能力較弱，在較強濃度的淋洗液下無法實現(xiàn)良好的分離，且較早出峰。因此，本研究選擇較低的淋洗液強度。由于PO43－在Ion Pac AS11-HC陰離子交換分析柱中的保留較強，需要使用較強濃度的淋洗液縮短分析時間，因此綜合考慮分離度情況和分析時間，最終確定了“2.1”項下的試驗條件。結(jié)果表明，各無機陰離子能實現(xiàn)良好分離，每個陰離子的分離度均≥1.5。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品中無機陰離子含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of inorganic anion content determination of samples（n＝3，mg/g）

3.2 提取溶液的優(yōu)化

由于需要提取樣品中的COO－、NO2－、SO42－、C2O42－、PO43－等無機陰離子，而堿性溶液能夠使樣品更容易釋放上述離子，因此采用堿性溶液提取樣品。但若堿性溶液體積分數(shù)過高，會對儀器和色譜柱不利，而溶液體積分數(shù)過低，則不能有效釋放樣品中的陰離子，因此本試驗分別考察了0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%體積分數(shù)的氫氧化鉀溶液對樣品中各無機陰離子的提取效率。結(jié)果表明，各無機陰離子的總平均提取回收率分別為72.78%、89.38%、96.28%、96.42%、84.16%。綜合考慮提取率和溶液體積分數(shù)對儀器的影響，最終選擇0.1%氫氧化鉀溶液作為提取溶液。

3.3 加速溶劑萃取的優(yōu)化

根據(jù)溫度（40、60、80、100 ）、靜態(tài)時間（5、10、15、20 min）、循環(huán)次數(shù)（1、2、3、4次）、沖洗體積（5、10、20、40 mL）和沖洗時間（10、30、60、90 s）5因素4水平設(shè)計單因素試驗，考察不同因素對各無機陰離子提取率的影響。按單因素試驗考察，結(jié)果表明提取溫度和循環(huán)次數(shù)對提取率的影響較大。溫度對某些無機陰離子如Cl－的提取率影響較小，對某些無機陰離子如NO2－和SO42－提取率的影響較明顯。綜合考慮，最終選擇40 為提取溫度。循環(huán)次數(shù)對提取率也有較明顯的影響，這可能是因為循環(huán)次數(shù)越多，樣品中無機陰陰離子釋放越充分的緣故，當(dāng)無機陰離子釋放完全，循環(huán)次數(shù)增加，提取率將趨于穩(wěn)定。為了縮短提取時間，本研究循環(huán)次數(shù)選擇3次。靜態(tài)時間、沖洗體積和沖洗時間對各無機陰離子的提取率的影響較小。為了節(jié)省資源和時間，靜態(tài)時間最終選擇10 min，沖洗體積為10 mL，沖洗時間為30 s。因此，最后確定加速溶劑萃取的條件為萃取溫度40 ，靜態(tài)循環(huán)10 min，循環(huán)3次，沖洗體積10 mL，沖洗時間30 s。

3.4 樣品含量分析

研究結(jié)果表明，黃連上清片的樣品中常見無機陰離子的含量差異明顯，其中SO42－含量明顯高于其他陰離子，而樣品中均未檢測出NO2－，其他陰離子的含量均在0.15～2.43 mg/g間，含量較低，根據(jù)對常見無機陰離子的認識，少量的氟化物能夠預(yù)防齲齒；氯離子可以調(diào)節(jié)人體水分，滲透壓和酸堿平衡；硝酸鹽和亞硝酸鹽是人體中典型的有害陰離子；過量攝入硫酸鹽，會出現(xiàn)腸胃功能紊亂，腹脹腹瀉等生理癥狀[13]。而該藥中硫酸鹽濃度如此之高，對人體的影響應(yīng)該引起重視，有待進一步的藥理研究。雖然，目前還沒有藥理學(xué)的證據(jù)證明這些無機陰離子在該藥中具體的藥理作用，但其理化指標的明顯變化可說明生產(chǎn)或運輸過程環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)了問題，需要及時進行檢查和質(zhì)量監(jiān)控，以保證藥品的安全性，同時為進一步的研究提供依據(jù)。

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（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of 9 Common Inorganic Anions in Huanglian Shangqing Tables by Accelerat-ed Solvent Extraction-ion Chromatography

HU Enze1，WEI Ming2，HUANG Zhenghui2（1.Pharmacy Dept.of Western Medicine，the Affiliated Hospital of Jianghan University/Wuhan Sixth Hospital，Wuhan 430015，China；2.Dept.of Tuberculosis，Wuhan Medical Treatment Center，Wuhan 430023，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of 9 common inorganic anions in Huanglian shangqing tablet.METHODS：The accelerated solvent extraction-ion chromatography was adopted.Inorganic anions were determined by Ion Pac AS11-HC anion exchange column，protected by Ion Pac AG11-HC column and eluted by hydroxide potassium solution（gradient elution）at the flow rate of 1.2 mL/min.The column temperature was set at 30 ，elution time was 18 min，and sample volume was 25 mL.RESULTS：The linear ranges of fluorinion，formate ion，nitrite ion，bromide ion，nitrate ion，sulfate ion，oxalate ion and phosphate ion were 0.1-5 mg/L（r＝0.999 0-0.999 9）.The limits of quantitation were 0.020，0.078，0.030，0.058，0.052，0.068，0.084，0.064，0.074 mg/L，and the limits of detection were 0.005，0.024，0.008，0.017，0.015，0.022，0.026，0.020，0.021 mg/L，respectively.RSDs of precision，stability and repeatability were all lower than 4.0%；recoveries were 80.00%-125.08%（RSD ranged 0.97%-2.47%）.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and repeatable，and can be used for 9 common inorganic anions in Huanglian shangqing tablet.

Accelerated solvent extraction；Ion chromatography；Huanglian shangqing tablet；Inorganic anion

R917

A

1001-0408（2017）12-1706-05

2016-09-26

2016-11-25）

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：pharmacydong@163. com

#通信作者：主治醫(yī)師。研究方向：臨床醫(yī)學(xué)。E-mail：13080668635@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.34