張雪玲，王超眾，賈首時(shí)，于曉秋，張連成#（.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥劑科，黑龍江齊齊哈爾6006；.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江齊齊哈爾 6005）

HPLC法測(cè)定注射用鹽酸哌甲酯中的有關(guān)物質(zhì)

張雪玲1＊，王超眾2，賈首時(shí)2，于曉秋1，張連成2#（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥劑科，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江齊齊哈爾 161005）

目的：建立測(cè)定注射用鹽酸哌甲酯中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters symmetry C18，流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為35 ，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：雜質(zhì)A、雜質(zhì)B檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍均為0.02～3.0 μg/mL（r均為0.999 8）；定量限分別為0.2、0.6 ng，檢測(cè)限分別為0.06、0.2 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.2%～100.0%（RSD＝0.56%，n＝9）、98.0%～100.3% （RSD＝0.70%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于注射用鹽酸哌甲酯中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

鹽酸哌甲酯；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)；雜質(zhì)A；雜質(zhì)B

鹽酸哌甲酯是藥效介于苯丙胺和咖啡因之間的一種中樞神經(jīng)興奮藥，能改善神經(jīng)活動(dòng)，解除疲勞感，小劑量可通過(guò)動(dòng)脈化學(xué)感受器反射性興奮神經(jīng)中樞，大劑量可直接興奮延髓中樞[1-3]；臨床上主要用于治療巴比妥類(lèi)藥物引起的嗜睡、倦怠、呼吸抑制，各種憂(yōu)郁癥，神經(jīng)官能癥等，是治療注意力缺陷和多動(dòng)障礙的首選藥物[4-5]。目前，測(cè)定該制劑中有關(guān)物質(zhì)的方法為薄層色譜法，但該方法靈敏度低、專(zhuān)屬性差[6]。根據(jù)該制劑的合成路線(xiàn)，雜質(zhì)A、B均為成品中可能存在的原料、中間體和降解產(chǎn)物[7-8]，且目前尚未有同時(shí)測(cè)定該制劑中雜質(zhì)A、B的報(bào)道。為此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定注射用鹽酸哌甲酯中有關(guān)物質(zhì)的方法，以期為完善注射用鹽酸哌甲酯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括2489紫外檢測(cè)器、Quick-Start Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211D型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-QAdvantageA10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸哌甲酯（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：121102、130401、130901，規(guī)格：20 mg/支；蘇州第壹制藥有限公司，批號(hào)：140311、130801、131109，規(guī)格：20 mg/支）；鹽酸哌甲酯對(duì)照品（上海博頓生物化工有限公司，批號(hào)：100305-201401，純度：99.9%）；雜質(zhì)A對(duì)照品（批號(hào)：201302-1401，純度：99.8%）、雜質(zhì)B對(duì)照品（批號(hào)：201302-1703，純度：99.8%）均購(gòu)自深圳菲斯生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35 ；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對(duì)照品各10 mg，置于同一100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述混合對(duì)照品貯備液1 mL，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸哌甲酯20 mg），置于50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.3 空白溶液 取流動(dòng)相適量作為空白溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱(chēng)取鹽酸哌甲酯對(duì)照品20 mg，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對(duì)照品各10 mg，置于同一50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度＞3.0；理論板數(shù)以鹽酸哌甲酯峰計(jì)為4 000，保留時(shí)間為10.7 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 破壞性試驗(yàn)

2.4.1 光破壞樣品溶液 取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸哌甲酯20 mg），置于50 mL量瓶中，置于4 500 lx日光燈下照射24 h，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.2 酸破壞樣品溶液 取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸哌甲酯20 mg），置于50 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液10 mL，搖勻，置于80 水浴中加熱2 h，放冷至室溫，加1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.3 堿破壞樣品溶液 取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸哌甲酯20 mg），置于50 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，置于80 水浴中加熱2 h，放冷至室溫，加1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至中性，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.4 氧化破壞樣品溶液 取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸哌甲酯20 mg），置于50 mL量瓶中，加10%過(guò)氧化氫溶液10 mL，搖勻，置于80 水浴中加熱1 h，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.5 高溫破壞樣品溶液 取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸哌甲酯20 mg），置于50 mL量瓶中，置于120 烤箱中加熱2 h，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

精密量取上述各破壞樣品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖2。由圖2可知，各降解產(chǎn)物峰、鹽酸哌甲酯峰與雜質(zhì)A峰和雜質(zhì)B峰完全分離，說(shuō)明本方法專(zhuān)屬性較好。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of destructive test

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液適量，加流動(dòng)相制成每1 mL含雜質(zhì)A、雜質(zhì)B均為0.02、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 μg的系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以雜質(zhì)A、雜質(zhì)B質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得雜質(zhì)A、雜質(zhì)B回歸方程分別為y＝4.382×104x－5.148×103（r＝0.999 8）、y＝4.423×104x－5.162×103（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍均為0.02～3.0 μg/ mL。

2.6 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的LOQ分別為0.2、0.6 ng，LOD分別為0.06、0.2 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B峰面積的RSD分別為0.46%、0.52%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：121102）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B峰面積的RSD分別為0.64%、0.58%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：121102）適量，置于50 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液7 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的殘留量。結(jié)果，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的平均殘留量分別為0.06%、0.02%，RSD分別為0.52%、0.97%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：121102）適量，共9份，分別置于50 mL量瓶中，加入低、中、高質(zhì)量的雜質(zhì)A、雜質(zhì)B對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取6批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Results of related substance determination （n＝3，%）

3 討論

筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液等為流動(dòng)相時(shí)對(duì)雜質(zhì)A、雜質(zhì)B峰分離度的影響。結(jié)果，以甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B峰峰型不好，理論板數(shù)均較低；以甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（60∶40，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B峰峰型較好，且與鹽酸哌甲酯色譜峰達(dá)到完全分離，各色譜峰理論板數(shù)均≥4 000。因此，本試驗(yàn)選擇甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（60∶40，V/V）為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于注射用鹽酸哌甲酯中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

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（編輯：劉 柳）

Determination of Related Substances in Methylphenidate Hydrochloride for Injection by HPLC

ZHANG Xueling1，WANG Chaozhong2，JIA Shoushi2，YU Xiaoqiu1，ZHANG Liancheng2（1.Dept.of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College，Heilongjiang Qiqihar 161006，China；2.Qiqihar Center for Food and Drug Control，Heilongjiang Qiqihar 161005，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of related substances in Methylphenidate hydrochloride for injection.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Waters symmetry C18column with mobile phase consisted of methanol-0.01 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution（60∶40，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm，the column temperature was 35 and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear range of impurity A and B were 0.02-3.0 μg/mL（r＝0.999 8）.The limits of quantitation were 0.2，0.6 ng，and the limits of detection were 0.06，0.2 ng，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility were all lower than 2.0%；recoveries were 98.2%-100.0%（RSD＝0.56%，n＝9），98.0%-100.3%（RSD＝0.70%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and suitable for the determination of related substance in Methylphenidate hydrochloride for injection.

Methylphenidate hydrochloride；HPLC；Related substance；Impurity A；Impurity B

R927.2

A

1001-0408（2017）12-1711-03

2016-04-30

2016-12-21）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話(huà)：0452-2739694

#通信作者：主任藥師。研究方向：藥物分析。電話(huà)：0452-2798729。E-mail：zhangliancheng_ren@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.35