幾種陽(yáng)離子和葡萄糖對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響

龔進(jìn)玲　柴毅　羅靜波

關(guān)鍵詞：達(dá)氏鱘；子一代；精子活力；陽(yáng)離子；葡萄糖

中圖分類(lèi)號(hào)：S965.215 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0257—03

達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus Dumeril）隸屬鱘形目、鱘科、鱘屬，為我國(guó)較大型淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，現(xiàn)主要分布于金沙江下段和長(zhǎng)江上游干流。由于過(guò)度捕撈、水體污染以及水利工程建設(shè)等諸多因素，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，野生種群資源不斷下降，達(dá)氏鱘的分布區(qū)逐漸縮小。于1996年被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）列入紅皮書(shū)中，并被評(píng)為國(guó)家一級(jí)野生保護(hù)動(dòng)物。2007年成功獲得子二代達(dá)氏鱘魚(yú)苗之后，達(dá)氏鱘規(guī)?；斯し敝骋踩〉弥卮笸黄?。目前達(dá)氏鱘的報(bào)道較少且不系統(tǒng)，主要包括消化系統(tǒng)、池塘養(yǎng)殖、分子進(jìn)化、形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面。

魚(yú)類(lèi)精子活力與水環(huán)境（鹽度、溫度、pH值、滲透壓、離子）、親魚(yú)激素水平及繁殖季節(jié)等因素有關(guān)，這也是魚(yú)類(lèi)精子生理特性與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果。在魚(yú)類(lèi)繁育中，精子活力能反映精液質(zhì)量并預(yù)測(cè)受精率，因此研究精子生物學(xué)是非常必要的，并且可為精子冷凍保存提供理論依據(jù)，進(jìn)一步優(yōu)化冷凍程序。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子生物學(xué)的研究，探討精子與陽(yáng)離子及葡萄糖之間的關(guān)系，可對(duì)現(xiàn)行達(dá)氏鱘淡水人工養(yǎng)殖技術(shù)有積極指導(dǎo)作用，還可為提高全人工繁殖的受精率以及以后該魚(yú)的精子稀釋液和保存液的配制提供科學(xué)理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1人工蓄養(yǎng)子一代達(dá)氏鱘親本 達(dá)氏鱘親本是由四川宜賓珍稀水生動(dòng)物研究所經(jīng)野生中華鱘人工繁殖所獲得的子一代個(gè)體。2006年運(yùn)輸至中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所中華鱘繁育基地培育，于2013年4月11—16日實(shí)施人工繁育，共催產(chǎn)2尾雄魚(yú)和2尾雌魚(yú)。

1.1.2精子獲得 利用B超對(duì)達(dá)氏鱘性腺發(fā)育進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并篩選成熟親鱘開(kāi)展人工繁殖催產(chǎn)。采用一針注射法對(duì)子一代達(dá)氏鱘催產(chǎn)，注射LHRH-A₂催產(chǎn)劑12 h后分6批次采集精液，合計(jì)采精量300 mL。所獲得的精液裝入干燥潔凈的雙層塑料保鮮袋中，充入純氧氣后放入4℃冰箱中冷藏保存，每4 h換氣1次。

1.1.3試驗(yàn)溶液的配制 各試驗(yàn)溶液濃度梯度設(shè)置見(jiàn)表1。

1.2試驗(yàn)方法

精子的活力測(cè)定方法參照嚴(yán)安生等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本次試驗(yàn)測(cè)量快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命，即激液與啟動(dòng)液混合開(kāi)始，視野中70%以上的精子轉(zhuǎn)入慢速運(yùn)動(dòng)為止，為快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（fast movement time，以下簡(jiǎn)稱(chēng)FT）。精子激活開(kāi)始到95%以上的精子停止顫動(dòng)所經(jīng)歷的時(shí)間，為壽命時(shí)間（life time，以下簡(jiǎn)稱(chēng)LF）。每個(gè)濃度的溶液中同一樣本精子活動(dòng)情況的觀測(cè)重復(fù)3次，最后結(jié)果取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS V8.02統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1 NaCl溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響

NaCl溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響見(jiàn)圖1。隨著NaCl溶液濃度升高，LT不斷上升。在NaCl濃度為0.25%時(shí)LT最長(zhǎng)，為219.67 s。而后隨著濃度升高急速下降。精子FT呈上升趨勢(shì)，其峰值（66.67 s）出現(xiàn)在濃度為0.20%時(shí)，當(dāng)濃度大于0.20%后FT逐漸下降。

方差分析結(jié)果表明，NaCl濃度為0.20%時(shí)的FT與其他濃度之間差異顯著（P<0.05）。NaCl濃度為0.25%時(shí)LT與其他濃度之間差異顯著（P<0.05）。

2.2 KCl溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響

不同濃度KCl溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響見(jiàn)圖2。子一代達(dá)氏鱘精子對(duì)K⁺含量變化非常敏感。LT與FT變化規(guī)律相似，隨著KCl溶液濃度升高，LT和FT呈逐漸上升的狀態(tài)，在其濃度為0.000 4%時(shí)，LT、FT分別達(dá)到124.67、52.67 s。當(dāng)KCl溶液濃度超過(guò)0.000 4%后子一代達(dá)氏鱘精子LT和FT急速下降。

方差分析結(jié)果表明，KCl濃度為0.000 4%時(shí)的FT、LT與其他各濃度組之間差異顯著（P<0.05）。0.010 0%、0.001 2%、0.001 4%、0.001 6%KCl溶液濃度組所對(duì)應(yīng)的LT之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.3 CaCl₂溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響

不同濃度CaCl₂溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響見(jiàn)圖3。隨著CaCl2濃度逐漸增加，LT和FT呈上升趨勢(shì)，至濃度為0.10%時(shí)均達(dá)到最高值，分別為113.67、28.67 s。當(dāng)CaCl₂溶液濃度達(dá)到0.30%時(shí)，精子活力明顯受到抑制，大多數(shù)只是微微顫動(dòng)，極少數(shù)緩慢游動(dòng)。

方差分析結(jié)果表明，CaCl₂濃度為0.30%、0.40%和0.45%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的FT無(wú)顯著性差異（P<0.05），0.10%CaCl₂濃度組所對(duì)應(yīng)的Fr、TJT與其他各濃度組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

2.4 MgCl₂溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響

不同濃度MgCl2溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響見(jiàn)圖4。隨著MgCl2濃度不斷上升，精子LT、FT開(kāi)始不斷上升。濃度為0.30%時(shí)精子LT最長(zhǎng)，為102 s；FT也最長(zhǎng)，為25 s。而后隨著MgCl₂溶液濃度的上升呈明顯下降趨勢(shì)。

方差分析結(jié)果表明，MaCl₂濃度為0.30%時(shí)FT與其他濃度組之間差異顯著（P<0.05）。0.25%和0.40%MgCl2濃度組所對(duì)應(yīng)的LT無(wú)顯著性差異（P>0.05），濃度為0.30%時(shí)所對(duì)應(yīng)的LT與其他各濃度組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

2.5葡萄糖溶液對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響

由圖5可知，子一代達(dá)氏鱘精子在不同濃度葡萄糖溶液中活力存在明顯差異。隨著葡萄糖溶液濃度逐漸增加，TJT和FT呈緩慢趨勢(shì)延長(zhǎng)，在濃度為0.60%時(shí)活力明顯增加，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到0.70%時(shí)LT、FT最長(zhǎng)，分別為259、74.67 s。而后隨著濃度升高其活力呈下降趨勢(shì)。

方差分析結(jié)果表明，0.70%葡萄糖濃度組所對(duì)應(yīng)的FT與其他各組之間存在顯著性差異（P<0.05）。0.20%、0.60%、0.70%葡萄糖濃度組所對(duì)應(yīng)的LT之間無(wú)顯著性差異（P>0.05），其中，0.70%濃度組所對(duì)應(yīng)的LT達(dá)到峰值。

3討論

3.1 NaCl、KCl溶液對(duì)精子活力的影響

魚(yú)類(lèi)精子在精巢和等滲溶液中是不運(yùn)動(dòng)的，但是卻存在著極強(qiáng)的潛在活動(dòng)能力。排出體外的精子一旦與水或非等滲溶液相結(jié)合便會(huì)激烈運(yùn)動(dòng)，即激活。精漿與外部介質(zhì)具有差異性，體現(xiàn)在離子組成成分和滲透壓上。魚(yú)類(lèi)精子的抑制與激活機(jī)制與種類(lèi)有關(guān)，其活力與精子對(duì)離子和滲透壓的敏感程度有關(guān)。Morisawa等表明鮭科（Salmonidae）魚(yú)類(lèi)精漿中高出血漿數(shù)倍的K⁺是抑制精子運(yùn)動(dòng)的因素，而精漿中K⁺含量是血漿的18～29倍的鯉科（Cyprinidae）魚(yú)類(lèi)，其K⁺含量不阻止精子運(yùn)動(dòng)，反而能提高精子運(yùn)動(dòng)速度。鱘魚(yú)類(lèi)精子的敏感性由精漿的成分和Na⁺含量決定。離子對(duì)不同魚(yú)類(lèi)精子的影響效果具有很大差異，研究理化因子對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子活力的影響對(duì)現(xiàn)行人工繁殖技術(shù)的指導(dǎo)十分必要。

Na⁺是魚(yú)類(lèi)精漿重要組成成分和構(gòu)成滲透壓的主要離子。胭脂魚(yú)（Myxocyprinus asiaticus）精子在0.60%NaCl濃度時(shí)快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)；0.30%NaCl能延長(zhǎng)翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaefor）精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間；劉鑒毅等發(fā)現(xiàn)中華鱘（Acipenser sinensis Gray）精子在0.10%NaCl溶液中快速運(yùn)動(dòng)最長(zhǎng)。本試驗(yàn)中測(cè)得子一代達(dá)氏鱘精子在NaCl溶液濃度為0.25%時(shí)壽命時(shí)間最長(zhǎng)，在0.20%時(shí)陜速運(yùn)動(dòng)時(shí)間最強(qiáng)，兩者變化規(guī)律相似。

鱘魚(yú)類(lèi)精子對(duì)K⁺濃度的變化最為敏感。從西伯利亞鱘（Acipenser baerii Brandt）、湖鱘（Acipenser fulvescens）和中華鱘精子在K⁺濃度變化中發(fā)現(xiàn)鱘魚(yú)類(lèi)精子對(duì)低濃度K⁺的敏感性極強(qiáng)，但活力可受低濃度K⁺調(diào)控。Alavi等研究表明K⁺是抑制鱘魚(yú)類(lèi)精子在精漿中活動(dòng)的主要因子。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)K⁺濃度大于0.000 4%時(shí)精子壽命時(shí)間和快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸縮短，說(shuō)明高濃度的K⁺對(duì)精子有明顯的抑制作用，而K⁺含量只有低于精漿濃度時(shí)才能增強(qiáng)精子活力，延長(zhǎng)壽命時(shí)間。

NaCl、KCl對(duì)精子活力的影響都表現(xiàn)在滲透壓方面。當(dāng)精子在水中活動(dòng)時(shí)，內(nèi)外滲透壓的差距促使精子調(diào)節(jié)平衡，從而消耗大量的自身能量。若將精子處于等滲溶液中，必然會(huì)使存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，原因在于調(diào)節(jié)滲透壓時(shí)所用的能量轉(zhuǎn)用于維持其生命活動(dòng)。因此，在人工繁殖過(guò)程中配制與親本滲透壓相當(dāng)?shù)南♂屢海瑢?duì)提高精子受精率、增加漁業(yè)產(chǎn)量有重要意義。

3.3葡萄糖對(duì)精子活力的影響

葡萄糖、半乳糖、果糖是精漿的重要成分碳水化合物中主要成分。Gardiner認(rèn)為體外授精的魚(yú)類(lèi)精子可利用細(xì)胞外源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為精子運(yùn)動(dòng)提供能量。已有研究表明，適宜的葡萄糖濃度可明顯延長(zhǎng)白斑狗魚(yú)（Esox lucius）、高白鮭（Coregouns peled）及中華鱘精子的活動(dòng)時(shí)間。在本次試驗(yàn)中，可以看出葡萄糖在適宜濃度時(shí)有延長(zhǎng)子一代達(dá)氏鱘精子壽命的作用，這與上述研究觀點(diǎn)一致。表明子一代達(dá)氏鱘精子可以利用外源性葡萄糖補(bǔ)充在整個(gè)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)中所消耗的能量，從而提高精子壽命時(shí)間。

3.4本研究的局限性

精子活力能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)受精率，而精子受精率的大小直接影響人工繁殖效果，但會(huì)受到水環(huán)境的影響。本試驗(yàn)對(duì)子一代達(dá)氏鱘精子在幾種離子和葡萄糖下活力影響進(jìn)行初步試驗(yàn)，未對(duì)其授精效果進(jìn)行研究，其合適的人工授精激活液濃度未知，可在以后的研究中進(jìn)行探討。