梁梓強(qiáng)，梁士可，劉婷婷，李廣宏，王方海

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//昆蟲(chóng)學(xué)研究所，廣東 廣州510275)

白背飛虱18S核糖體基因克隆及系統(tǒng)發(fā)育*

梁梓強(qiáng)，梁士可，劉婷婷，李廣宏，王方海

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//昆蟲(chóng)學(xué)研究所，廣東 廣州510275)

以白背飛虱Sogatellafurcifera長(zhǎng)翅雌蟲(chóng)為材料，提取其基因組DNA，以已知的半翅目昆蟲(chóng)18S rDNA全序列和白背飛虱18S rDNA部分序列為參考，通過(guò)PCR擴(kuò)增出白背飛虱18S rDNA的未知部分序列，最后通過(guò)拼接，首次得到了白背飛虱18S rDNA的全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為1 891 bp，堿基組成比例均衡，分別為：24.1% A；23.7% C；27.7% G；24.5% T。將此全長(zhǎng)序列與分屬6個(gè)目(半翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、鞘翅目、等翅目)昆蟲(chóng)的18S rDNA序列進(jìn)行比較，一共發(fā)現(xiàn)有4個(gè)保守區(qū)域，其中第二個(gè)區(qū)域發(fā)生插入或缺失的情況最少。以18S rDNA第二保守區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)原同翅目昆蟲(chóng)多數(shù)均與半翅目昆蟲(chóng)菜蝽親緣關(guān)系較近，但原同翅目飛虱科昆蟲(chóng)，如白背飛虱、褐飛虱則與半翅目昆蟲(chóng)菜蝽的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明近年來(lái)將原同翅目昆蟲(chóng)全部劃歸為半翅目還有待商榷之處。

核糖體；18S rDNA；白背飛虱

白背飛虱Sogatellafurcifera(Horvath)屬半翅目Hemiptera飛虱科Delphacidae,是糧食作物水稻的重要害蟲(chóng)。白背飛虱成蟲(chóng)常會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)、短兩種不同的翅型個(gè)體，長(zhǎng)翅型個(gè)體與短翅型個(gè)體相比有較強(qiáng)的活動(dòng)能力，可以進(jìn)行遠(yuǎn)距離遷飛擴(kuò)散，但是繁殖能力較弱，白背飛虱不同翅型個(gè)體的比率是預(yù)測(cè)其種群動(dòng)態(tài)變化的關(guān)鍵指標(biāo)之一[1]。

昆蟲(chóng)基因組存在DNA甲基化現(xiàn)象[2]，同時(shí)DNA的甲基化與昆蟲(chóng)的多型現(xiàn)象密切相關(guān)[3]。白背飛虱中，DNA甲基化的研究主要圍繞其對(duì)性別分化[4-5]和翅型分化[6]的作用展開(kāi)了探索。利用甲基化敏感性代表性差異分析法(MS-RDA)分析白背飛虱長(zhǎng)、短翅型雌成蟲(chóng)基因組，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)特異的DNA甲基化片段分別與18S和28S rDNA高度同源[6]。因此獲得核糖體基因全長(zhǎng)序列將有助于進(jìn)一步分析其甲基化的具體式樣和水平，找出不同翅型個(gè)體間存在的差異，從而有可能弄明白核糖體DNA甲基化對(duì)白背飛虱翅型分化的具體作用和機(jī)制。

真核生物核糖體是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，由大、小兩個(gè)亞基組成，主要成分為核糖體RNA和蛋白質(zhì)。核糖體RNA具有自我復(fù)制和剪切功能。20世紀(jì)80年代以來(lái)，伴隨著序列分析軟件和計(jì)算機(jī)的發(fā)展，核糖體基因被廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)的分子系統(tǒng)學(xué)研究[7]。

昆蟲(chóng)分類(lèi)經(jīng)典的方法主要以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，相對(duì)簡(jiǎn)單且快捷，但限制形態(tài)學(xué)鑒定的因素較多，如昆蟲(chóng)生活環(huán)境、分類(lèi)經(jīng)驗(yàn)不足等，所以只靠形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi)，難以保證絕對(duì)的準(zhǔn)確性。核糖體基因中18S rDNA具有序列高度保守性，并且許多生物的18S rDNA已被發(fā)表[8-9]，所以比較適合用于各類(lèi)生物系統(tǒng)發(fā)生等進(jìn)化關(guān)系的研究。

本研究參考了大量半翅目昆蟲(chóng)的18S rDNA全序列信息，克隆和分析了白背飛虱18S rDNA全長(zhǎng)序列，為日后研究白背飛虱核糖體基因全序列甲基化水平和翅型分化的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，我們將白背飛虱和六個(gè)目昆蟲(chóng)的18S rDNA序列進(jìn)行比較分析，并根據(jù)18S rDNA的同源保守區(qū)進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)的描繪，能為分子系統(tǒng)學(xué)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

白背飛虱成蟲(chóng)采自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田。將0.01 g長(zhǎng)翅雌成蟲(chóng)置于液氮中研磨成粉，其基因組DNA的提取采用Universal Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa)，具體方法和步驟參照該試劑盒的說(shuō)明書(shū)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從GenBank上搜索已經(jīng)發(fā)表的白背飛虱18S rDNA序列(登錄號(hào)JF773150，1 733 bp；登錄號(hào)JX556779，1 281 bp；登陸號(hào)HM017250，1 200 bp)和白背飛虱18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S核糖體序列(AB625607，AB625606，AB625605)，拼接成一條長(zhǎng)度為1 856 bp的18S rDNA序列。

根據(jù)已經(jīng)公布的半翅目昆蟲(chóng)的18S rDNA全序列(表1)，利用Megalign軟件分析表1中的8個(gè)序列和上述已拼接好的18S rDNA序列，可以得知拼接的白背飛虱18S rDNA不是完整序列，缺失5′端部分。

表1 半翅目昆蟲(chóng)18S rDNA全序列的登錄號(hào)
Table 1 Complete sequence of the Hemiptera 18S rDNA

SpeciesGenBankaccessionNo.PhilaenusspumariusU06480SpissistilusfestinusU06477HenestarisoschaniniAY324853LygushesperusU06476PachygronthaantennataAY324852HemiowoodwardiawilsoniAF131198OkanaganautahensisU06478HackeriellaveitchiAF004766

為了確定白背飛虱18S rDNA的5′端序列，我們分別對(duì)柑橘木虱(GCA_000475195.1)和褐飛虱(GCA_000757685.1)的基因組進(jìn)行分析，找到其18S rDNA及其上游1 000 bp序列，根據(jù)18S rDNA 和上游序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于擴(kuò)增白背飛虱18S rDNA缺失的5′端序列(圖1)，引物具體如下：

18S-F：5′ACGAATCATGAGCTGCTGAC 3′

18S-R：5′ATGGCTTAATCTTTGAGACAAG 3′

18S-F和18S-R預(yù)期擴(kuò)增的序列大小為515 bp。

圖1 PCR擴(kuò)增白背飛虱18S rDNA 5′序列Fig.1 PCR strategy to amplify 5′sequence of S.furcifera 18S rDNA 灰色部分為白背飛虱18S rDNA上游序列；黑色部分為白背飛虱18S rDNA序列； 矩形部分為序列保守區(qū)域；18S-F和18S-R為擴(kuò)增白背飛虱18S rDNA 5′端引物

1.3 PCR及檢測(cè)

PCR的反應(yīng)體系為：模板DNA 2 μL，上、下游引物各4 μL，Premix Taq(TaKaRa)25 μL，ddH2O 15 μL。PCR循環(huán)條件為：94 ℃ 30 s； 94 ℃ 20 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 24 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃ ∞。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行w=1%凝膠電泳檢測(cè)，然后將目的條帶純化回收，克隆并測(cè)序。

1.4 18S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中下載了昆蟲(chóng)綱6個(gè)目共9個(gè)18S rDNA的序列(表2)，結(jié)合白背飛虱18S rDNA全序列，利用DNAstar和MEGA5軟件進(jìn)行分析。

表2 昆蟲(chóng)18S rDNA序列來(lái)源
Table 2 The source of insect 18S rDNA sequence

OrderSpeciesGenBankaccessionNo.鞘翅目黃粉蟲(chóng)TenebriomolitorX07801雙翅目果蠅DrosophilamelanogasterNR133559膜翅目蚜繭蜂LipolexisscutellarisAY216699直翅目中華稻蝗OxyachinensisAY037173等翅目澳白蟻MastotermesdarwiniensisAY491152半翅目褐飛虱NilaparvatalugensJF773148半翅目沫蟬PhilaenusspumariusU06480半翅目褐色橘蚜ToxopteracitricidaAY216697半翅目菜蝽EurydemamaracandicaJX997807

2 結(jié)果與分析

2.1 白背飛虱18S rDNA基因克隆及序列分析

白背飛虱18S rDNA 5′端序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。將PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序完成后，與步驟1.2中已拼接出的白背飛虱18S rDNA序列進(jìn)行再次拼接。

根據(jù)表1中8個(gè)半翅目昆蟲(chóng)的18S rDNA 基因序列，比較分析18S rDNA基因的起始位點(diǎn)(圖3)，最終確定了白背飛虱18S rDNA全序列，共1 891 bp，其GenBank的登錄號(hào)為KU518352。白背飛虱18S rDNA全序列堿基組成分別為：24.1% A；23.7% C；27.7% G；24.5% T，堿基組成比例均衡。

2.2 昆蟲(chóng)18S rDNA同源性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

通過(guò)使用DNAstar中的MegAlign程序?qū)?個(gè)

18S rDNA序列進(jìn)行排序處理，比對(duì)發(fā)現(xiàn)4個(gè)具有較高同源性的區(qū)域，分別相當(dāng)于白背飛虱18S rDNA的1～202，335～629, 779～1 431和1 510～1 760 bp的序列。4個(gè)同源區(qū)域中，發(fā)生插入或缺失的幾率低，主要為轉(zhuǎn)換，而在非同源區(qū)域中，發(fā)生插入或缺失的幾率大大增加，如雙翅目或膜翅目昆蟲(chóng)在此區(qū)域就存在較多的插入序列。

圖2 白背飛虱18S rDNA基因5′端序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR products of S.furcifera 18S rDNA 5′sequenceM: DL-2000 DNA Marker ; 1:擴(kuò)增產(chǎn)物

基于以上的分析，如果根據(jù)18S rDNA全序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果就會(huì)不太可靠。由于在第二個(gè)同源區(qū)域中，出現(xiàn)插入或缺失的現(xiàn)象最少，所以本研究根據(jù)第二個(gè)同源區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，圖4為所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

根據(jù)圖4所示，我們發(fā)現(xiàn)白背飛虱和褐飛虱位于同一分支上，與雙翅目的果蠅親緣關(guān)系最接近，與鞘翅目的黃粉蟲(chóng)最遠(yuǎn)。而同屬半翅目的沫蟬、褐色橘蚜、菜蝽3種昆蟲(chóng)親緣關(guān)系接近，但與白背飛虱和褐飛虱的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 半翅目18S rDNA基因起始位點(diǎn)Fig.3 The initiation site of Hemiptera 18S rDNA黑色箭頭指向的核苷酸為半翅目18S rDNA基因起始位點(diǎn)

圖4 基于昆蟲(chóng)18S rDNA保守區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis of the 18S rDNA conserved domain

3 討 論

核糖體基因一直以來(lái)都是人們研究的對(duì)象，18S rDNA基因同樣也是白背飛虱研究的熱點(diǎn)之一[6, 10]。過(guò)去我們雖然能得到很多有關(guān)白背飛虱18S rDNA基因的信息，但是這些基因信息均為部分片段，使得所做的研究具有局限性。通過(guò)對(duì)白背飛虱雌雄個(gè)體和長(zhǎng)、短翅個(gè)體的MSAP圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化有可能參與了白背飛虱性別和翅型分化的調(diào)控[11]，其中不同翅型白背飛虱基因組中存在與18S rDNA同源的差異DNA甲基化片段。本研究首次得到了白背飛虱18S rDNA全序列，為18S rDNA基因的甲基化分析提供可靠的序列參考，并且為今后研究18S rDNA基因甲基化式樣和水平對(duì)白背飛虱性別和翅型分化的調(diào)控打下基礎(chǔ)。

堿基組合比例對(duì)系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建有較大的影響[12]，白背飛虱及其它用于構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的昆蟲(chóng)的18S rDNA的堿基組合比例均無(wú)偏異，故從18S rDNA基因角度可較為真實(shí)反映各目昆蟲(chóng)的進(jìn)化情況。原屬同翅目的白背飛虱、褐飛虱、沫蟬、褐色橘蚜與半翅目的菜蝽的親緣關(guān)系各有不同，沫蟬、褐色橘蚜與菜蝽較接近，而白背飛虱和褐飛虱與菜蝽則較遠(yuǎn)。如果從18S rDNA基因進(jìn)化角度來(lái)看，近年來(lái)把原同翅目昆蟲(chóng)全部劃歸為半翅目，似乎還值得商榷，因?yàn)轱w虱科昆蟲(chóng)與半翅目昆蟲(chóng)間親緣關(guān)系并不接近。

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Clonging and phylogenetic analysis of 18S rDNA gene fromSogatellafurcifera(Horvath)

LIANGZiqiang,LIANGShike,LIUTingting,LIGuanghong,WANGFanghai

(State Key Laboratory for Biocontrol and Institute of Entomology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

The long wing female adults ofSogatellafurciferawere selected to extract their genomic DNA. According to the complete 18S rDNA gene sequence from Hemiptera, the unknown 18S rDNA sequence ofS.furciferawas amplified by PCR. The complete 18S rDNA gene sequence ofS.furciferawas obtained for the first time by splicing the unknown and known 18S rDNA sequences, whole sequence length was 1 891 bp. Comparing 18S rDNA sequence fromS.furciferaand those from other insects, four conserved regions were found and the second region had the least insertion or deletion. Based on the second region, phylogenetic analysis was made and the results showed that most Homoptera insects used in this study had a close relatives withEurydemamaracandica(Hemiptera) except Delphacida.

ribosome; 18S rDNA;Sogatellafurcifera

2016-05-16 基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金(S2022020002353,031628)；國(guó)家自然科學(xué)基金(311771844)

梁梓強(qiáng)(1991年生)，男；研究方向：昆蟲(chóng)分子生物學(xué)；E-mail：616661857@qq.com

王方海(1965年生)，男；研究方向：昆蟲(chóng)生理生化 ；E-mail：lsswfh@mail.sysu.edu.cn

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.01.019

Q965

A

0529-6579(2017)01-0121-04