植物凝集素上調(diào)小鼠免疫器官MDSC細胞的研究

張瀟涵，李江超，劉 擎，周澤啟，仰明明，王麗京 （廣東藥科大學(xué)血管生物學(xué)研究所，廣東廣州510006）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

植物凝集素上調(diào)小鼠免疫器官MDSC細胞的研究

張瀟涵，李江超，劉 擎，周澤啟，仰明明，王麗京 （廣東藥科大學(xué)血管生物學(xué)研究所，廣東廣州510006）

目的：探討小鼠腹腔注射植物凝集素（PHA）后血液、脾臟、骨髓中的MDSC數(shù)量的變化，明確PHA對小鼠血液、脾臟、骨髓MDSC的作用.方法：小鼠腹腔注射PHA后，提取小鼠血液、脾臟及骨髓進行細胞裂解，標(biāo)記抗體后采用流式細胞儀進行檢測和分析.結(jié)果：PHA處理組小鼠的骨髓、脾臟、外周血中MDSC百分比明顯比生理鹽水組高，骨髓中生理鹽水組雙陽性平均為36.6%，而PHA組雙陽性達到56.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）.脾臟中，生理鹽水組雙陽性平均為3.5%，然而植物凝集素組雙陽性能達到11.5%左右，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）.外周血中，PHA處理組MDSC百分比明顯升高，對照組MDSC平均百分比占4.6%，而PHA組MDSC平均百分比占19.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）.結(jié)論：植物凝集素腹腔刺激小鼠后，可促使小鼠血液、脾臟、骨髓中MDSC濃度的上調(diào).

植物凝集素；MDSC細胞；細胞分化

0 引言

凝集素是一種糖結(jié)合蛋白，廣泛存在于動物、植物和微生物中.植物凝集素（Phytohaemagglutinin，PHA）是低聚糖（由D?甘露醇、氨基葡萄糖酸衍生物構(gòu)成）與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，屬于高分子糖蛋白類，存在于一些植物中.植物凝集素根據(jù)其來源可分為豆科凝集素（存于豆類種子中，可從豆類種子中提取出來）、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素、單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素、葫蘆科韌皮部凝集素、莧科凝集素等［1］，均屬于中藥提取物，且它們對紅細胞可產(chǎn)生一定的凝集作用，故而稱做植物血凝素或植物凝集素［2］.未成熟髓樣抑制細胞（Myeloid de?rived suppressor cells，MDSC）是一群異質(zhì)性細胞，來源于骨髓系統(tǒng)，包括未成熟的巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞等，其共同的表面標(biāo)志為Gr?1＋／CD11b＋，具有很強的免疫抑制作用，是引起腫瘤免疫逃逸的主要細胞群［3－5］.MDSC細胞在以往研究中，其升高主要是在腫瘤患者和荷瘤小鼠中觀察到的，MDSC能夠發(fā)揮強大的免疫抑制作用，在腫瘤發(fā)展中扮演重要角色.MDSC細胞能夠抑制機體免疫功能已經(jīng)被廣泛認可，PHA能夠刺激淋巴細胞增殖，而PHA與MDSC二者相互作用關(guān)系尚不清楚.目前豆科類凝集素已發(fā)現(xiàn)了70多種，且研究較為清楚，所以采用了豆科類凝集素用于研究.本研究探討了PHA對MDSCs的影響，為研究未患瘤狀態(tài)下MDSC細胞各項功能提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 小鼠C57BL／6小鼠購買自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK（粵）2013－0002.小鼠相關(guān)實驗獲得廣東藥科大學(xué)倫理委員會許可.

1.2 試劑和儀器1 mL注射器；EDTA.K2抗凝采血管；流式細胞術(shù)檢測抗體：Gr1?PE（貨號12?5931）；CD11a?FITC（貨號11?0112），抗體（購自eBioscience公司）；紅細胞裂解液（購買自life technologies）；尼龍篩網(wǎng)（貨號22363548），F(xiàn)isherbrand；流式細胞儀（型號：BD FACSCantoⅡ）.瑞氏?姬姆薩染色液（購自于珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；載玻片、蓋玻片（均購自于江蘇世泰實驗器材有限公司）；PHA（購自于廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所）.

1.3 實驗方法

1.3.1 PHA腹腔注射 取C57小鼠6～8周，腹腔注射濃度為10 mg／mL的PHA 0.2 mL，每隔24 h注射一次，連續(xù)注射3次.

1.3.2 骨髓MDSC檢測 將PHA腹腔注射后的小鼠麻醉處死后，取出小鼠后腿，在1XPBS緩沖液中將肌肉剝離，然后用1 mL PBS沖骨髓，吹打混勻，過70 μm尼龍篩網(wǎng)，取100 μL加入流式管中，各加入0.3 μL的Gr1和CD11b抗體，震蕩混勻，室溫避光孵育35 min，加入100 μL紅細胞裂解液進行裂解紅細胞，15 min后加入1 mL的PBS震蕩混勻，在低速離心機1500 r／min，離心5 min；棄掉上清，加入1 mL PBS震蕩混勻，在低速離心機1500 r／min，離心5 min；重復(fù)1次，棄上清，加入200 μL 1%多聚甲醛固定液固定，混勻，上流式細胞儀進行檢測.

1.3.3 脾臟MDSC檢測 將PHA腹腔注射后的小鼠麻醉處死后，將小鼠固定于夾板上，用手術(shù)器械取出脾臟，置于滅菌的1 mL冰凍1XPBS，輕輕研磨組織并吹打混勻，以下步驟同上.

1.3.4 血液MDSC檢測 將PHA腹腔注射后的小鼠乙醚麻醉后，眼眶取血，防止凝血現(xiàn)象，將血液置抗凝管中，取100 μL加入流式管中，各加入0.3 μL的Gr1和CD11b抗體，震蕩混勻，室溫避光孵育35 min，加入100 μL紅細胞裂解液進行裂解紅細胞，20 min后加入1 mL的PBS震蕩混勻，在低速離心機1500 r／min，離心5 min；棄掉上清，加入1 mLPBS震蕩混勻，在低速離心機1500 r／min，離心5 min；重復(fù)1次，棄上清，加入200 μL 1%多聚甲醛固定液固定，混勻，上流式細胞儀進行檢測.

1.3.5 血液、骨髓涂片 將PHA腹腔注射后的小鼠麻醉，眼眶取血滴在載玻片上，稍微晾干后，用甲醇固定10 min，進行吉姆薩染色；小鼠處死后，取出小鼠后腿，在1XPBS緩沖液中將肌肉剝離，然后用1mLPBS沖下骨髓，吹打混勻，5000 r／min，離心5 min，棄上清，將剩余混勻之后涂在在玻片上，甲醇固定10 min后，PBS沖洗自然晾干后，吉姆薩染色.

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法或中位表示，使用軟件Gradprim5.0，采用t檢驗，假設(shè)條件P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PHA刺激后，骨髓、脾臟、血液中的MDSC升高

采用0.9%氯化鈉生理鹽水和10 mg／mL植物凝集素，以0.2 mL／只分別腹腔注射6～8周齡C57小鼠，每組5只，每隔24 h注射一次，共3次.取出骨髓、脾臟及外周血標(biāo)上MDSC抗體（Gr1?PE，CD11b?FITC）進行流式檢測.流式細胞術(shù)是一種生物學(xué)技術(shù)，是利用流式細胞儀對懸液中的單細胞或其他生物粒子標(biāo)記的熒光信號進行檢測，實現(xiàn)高速、逐一的多種參數(shù)分析和分選的技術(shù).基于細胞自身的物理、化學(xué)特性，借助流式細胞儀的單細胞高速，通過閾值、光電倍增管電壓設(shè)置、陰性對照設(shè)置、熒光補償調(diào)節(jié)以及多方式設(shè)門等對細胞進行分析.流式儀上樣細胞數(shù)量為10000個.調(diào)節(jié)電壓及熒光補償，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙陽性代表MDSC，植物凝集素組在骨髓、脾臟、外周血MDSC明顯比生理鹽水組高，骨髓中生理鹽水組雙陽性平均為36.6%，而植物凝集素組雙陽性MDSCs細胞達到56.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖1）.脾臟中，生理鹽水組雙陽性平均為3.5%，然而植物凝集素組雙陽性能達到11.5%左右，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.0002，圖2）.同樣，外周血中，植物凝集素雙陽性明顯升高，對照組雙陽性平均百分比占4.6%，而實驗組雙陽性平均百分比占19.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.0005，圖3）.

圖1 植物凝集素腹腔注射對小鼠骨髓中MDSC的影響

圖2 植物凝集素腹腔注射對小鼠脾臟中MDSC的影響

圖3 植物凝集素腹腔注射對小鼠外周血中MDSC的影響

2.2 PHA刺激后造成骨髓細胞發(fā)生改變，而血涂片發(fā)生變化不大植物凝集素腹腔刺激小鼠后，其骨髓細胞變化明顯，吉姆薩染色后在顯微鏡下觀察，實驗組較對照組骨髓細胞數(shù)目明顯增多，其胞核變小，形態(tài)各樣，核變明顯.而血涂片中，染色深紫色的為淋巴細胞，胞漿較少，胞核較大，PHA腹腔刺激后，其淋巴細胞稍有增多，但不明顯（圖4）.

圖4 植物凝集素腹腔注射對小鼠骨髓細胞、外周血細胞產(chǎn)生影響，細胞數(shù)目增多，胞核變化多樣

3 討論

PHA提純后其成分含量多少可分為兩類，提純后蛋白含量較多的稱為PHA?P，糖蛋白多的則稱為PHA?M，需要進一步深入研究［6］.20世紀初期有研究表明植物凝集素對人和動物紅細胞有凝血作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用可作為一種有絲分裂原，通過激活小淋巴細胞使之轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，從而進行分裂增殖，同時可釋放出一些淋巴因子［7］；此外，PHA還具有使巨噬細胞的吞噬功能提高的能力［8－10］.近年研究發(fā)現(xiàn)PHA對病毒侵襲的細胞有殺傷作用，可對人體食管癌及肝癌細胞株發(fā)揮抑制作用，同樣發(fā)現(xiàn)對艾氏腹水癌也發(fā)揮抑制作用；可延長荷瘤小鼠的生存期［11－13］；此外，還能促進骨髓造血功能，提升白細胞數(shù)量，可以對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率造成影響［14－15］.在以往研究中，植物凝集素大都是作為免疫治療劑進行應(yīng)用的，其主要配合放療、化療用于腫瘤患者，尤其是免疫功能受損而引起的疾病，例如急性白血病、晚期絨癌、乳腺癌、腸癌、鼻咽癌、再生障礙性貧血、遷延性肝炎等［16－17］.在體外，主要用于細胞，刺激增殖作用.也有文章報道PHA誘導(dǎo)的免疫力反應(yīng)引起T細胞有絲分裂，會對不同種動物的繁殖階段造成不同影響［18］.上述研究均沒有涉及到MDSC，尚不清楚PHA對MDSC細胞的作用.而在本研究中發(fā)現(xiàn)植物凝集素進入血液、骨髓、脾臟中后MDSC的濃度升高.

有研究報道哺乳動物外源注射PHA，其靜止代謝率無明顯升高，進而說明PHA反應(yīng)對哺乳動物本身不會引起能量學(xué)變化［19］.由此小鼠狀態(tài)不會受到影響，本研究采用10 μg／mL PHA腹腔注射后，檢測小鼠骨髓、血液、脾臟中MDSC細胞，植物凝集素組在骨髓、脾臟、外周血MDSC（雙陽性代表MDSC）明顯比生理鹽水組高.MDSC細胞還通過促進腫瘤血管生成，促使腫瘤細胞侵襲及向遠處器官轉(zhuǎn)移等非免疫機制促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［20］.初步研究中發(fā)現(xiàn)植物凝集素能夠明顯刺激MDSC細胞上調(diào)，說明植物凝集素是對MDSC細胞這種異制性細胞群有一定的作用.尤其在骨髓中，植物凝集素對其影響更明顯.骨髓富含大量未分化成熟的細胞，是機體造血系統(tǒng)，能制造出紅細胞、血小板和各種白細胞.紅細胞成熟后進入機體循環(huán)，白細胞能夠殺滅病原菌，由此骨髓也是機體重要的免疫器官.其在植物凝集素作用下，MDSC細胞大量增多，主要在荷瘤小鼠中MDSC升高.在炎癥、病毒感染、自身免疫疾病、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下同樣會導(dǎo)致MDSC積累.研究中小鼠狀態(tài)尚可，由此推測植物凝集素作用引起了某些因子的變化進而促使未分化細胞轉(zhuǎn)化為MDSC細胞，導(dǎo)致MDSC在骨髓積累.骨髓涂片中也可發(fā)現(xiàn)其細胞數(shù)目增多，進而能說明PHA確實影響了骨髓細胞分化.脾臟機體最大的免疫器官富含淋巴細胞和巨噬細胞，發(fā)揮細胞免疫和體液免疫功能，植物凝集素作用下，MDSC細胞也上調(diào)，說明PHA對脾臟中免疫細胞功能產(chǎn)生影響，促使MDSC大量形成，也可能是機體對外來PHA的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致某些炎癥因子發(fā)生改變，誘導(dǎo)MDSC細胞分泌.PHA在體外會引起紅細胞凝集現(xiàn)象已被廣泛認知，同時也有文獻報道PHA在體內(nèi)達到一定濃度時同樣也會引發(fā)血液凝集［21］.在PHA腹腔刺激后發(fā)現(xiàn)外周血中MDSC細胞升高明顯，這說明PHA在體內(nèi)對血液系統(tǒng)的影響不僅在凝血系統(tǒng)方面，免疫力反應(yīng)也很明顯，同時也有可能是骨髓中MDSC進入血液，使血液含有大量MDSC.同時有研究報道，植物凝集素會引起外周單核細胞分泌IL?6［15］，IL?6可誘導(dǎo)MDSC的產(chǎn)生，進而使得血液中MDSC增多.提示PHA在促進淋巴細胞增殖的同時可能降低了細胞的免疫功能，增加了MDSC的數(shù)量.

直接應(yīng)用PHA可促進MDSC細胞增多，但對于免疫細胞尤其淋巴細胞變化待我們進一步研究驗證.本研究PHA是通過何種途徑調(diào)節(jié)了MDSC細胞，而這種增多的MDSC細胞是否也具有免疫抑制功能尚不清晰.MDSC在促進腫瘤發(fā)展中扮演重要角色，然而對MDSC的亞群和種類尚不清晰.這為我們研究MDSC細胞扮演角色提供了很好的方法，便于以后在未患瘤狀態(tài)下MDSC細胞各項功能的研究.這對了解MDSC的多樣性有一定的臨床意義，同樣PHA作為免疫學(xué)中重要的藥物，具有較好的應(yīng)用前景.

研究中小鼠為未荷瘤狀態(tài)，沒有在這方面進行研究.植物凝集素，尤其是豆類植物凝集素，在生長進化中形成了一種很強的抵御病蟲害和動物消化的成分［22－23］，因此對動物有較強的抗?fàn)I養(yǎng)作用，表現(xiàn)出急性惡心嘔吐和腹瀉，這與我們研究中發(fā)現(xiàn)實驗小鼠精神狀態(tài)差這一現(xiàn)象一致，其各器官的變化需要進一步全面觀察.

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Study on the effect of phytohaemagglutinin on upregulating MDSCs of immune organ in mice

ZHANG Xiao?Han，LI Jiang?Chao，LIU Qing，ZHOU Ze?Qi，YANG Ming?Ming，WANG Li?Jing
Vascular Biology Research Institute of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China

AIM：To investigate the changes in the number of MDSCs in blood，spleen and bone marrow after intraperitoneal injection of phytohaemagglutinin（PHA）in mice，and confirm the effects of PHA on MDSC in blood，spleen and bone marrow.METHODS：After intraperitoneal injection of PHA in mice，the red cell extracted from the blood，spleen and bone marrow was ly?sised，and MDSCs altering of labeled antibody was detected and analysed using flow cytometry.RESULTS：Percentage of MDSCs treated by Phytohaemagglutinin was significantly higher than that of the control group in bone marrow，spleen，peripheral blood.More detail，MDSCs in control group was 36.6%in bone marrow，while MDSCs in Phytohaemagglutinin group reached 56.4%，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Average val?ue of MDSCs in spleen was 3.5%in control group，however that of the Phytohaemagglutinin group was 11.5%，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Similarly，it is difference in peripheral blood（4.6%vs19.8%）.CONCLUSION：PHA can promote up?regulation of MDSC in blood，spleen and bone marrow in mice.

Phytohaemagglutinin；MDSCs；cell differentiation

Q95?33

A

2095?6894（2017）04?15?04

2017－02－17；接受日期：2017－03－03

國家自然科學(xué)基金（81472336，31471290），廣東省科技計劃（51343072，2014A020212313，2015A030302086）

張瀟涵.E?mail：1123796468＠qq.com

王麗京.博士，教授.研究方向：分子腫瘤病理學(xué)、模式動物疾病模型.E?mail：wanglijing62＠163.com