葡萄籽原花青素聚合度分析方法的研究

高德艷，梁紅敏，任繼波，張晶瑩，胡文效

（山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南250100）

葡萄籽原花青素聚合度分析方法的研究

高德艷，梁紅敏，任繼波，張晶瑩，胡文效*

（山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南250100）

優(yōu)化葡萄籽原花青素物質(zhì)的量測定方法，確定比色條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法線性范圍為0.055 μmol/mL～0.275 8 μmol/mL，檢出限為2.912×10－4μmol/mL，加標(biāo)回收率在95%～100%，精密度RSD為0.757 1%；通過建立原花青素聚合度計(jì)算方法，測定不同原花青素聚合度進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該法靈敏度高、重現(xiàn)性良好，適用于不同原花青素聚合度的分析。

原花青素；聚合度；葡萄籽

隨著我國葡萄產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，葡萄籽作為葡萄產(chǎn)業(yè)的資源性副產(chǎn)物具有很高的利用價值。葡萄籽中含有豐富的原花青素，原花青素（Proanthocyanidins）是由兒茶素、表兒茶素及其沒食子酸酯類縮合而成的多酚類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。根據(jù)聚合度不同，原花青素分為低聚體原花青素（OPC，聚合度DP≤5）和高聚體原花青素（PPC，聚合度＞5）；由于單體組成及成鍵類型不同，同一聚合度原花青素有多種異構(gòu)體，形成復(fù)雜混合物。不同聚合度原花青素抗氧化活性不同，大量研究證實(shí)隨著原花青素聚合度的增加，其抗氧化活性和對羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力逐漸降低[1－2]。

文獻(xiàn)中原花青素聚合度的分析方法主要有硫解－HPLC法[3]、RP－HPLC－MS聯(lián)用法[4]、薄層層析法及凝膠滲透色譜法[5]。其中凝膠色譜法是利用不同分子量聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)品測定原花青素分子量，該法適用于大分子單一化合物分子量的測定，不適用于低分子量原花青素及混合原花青素聚合度的測定。Kennedy等[6]用RP－HPLC法分析酸催化裂解原花青素產(chǎn)物，得到原花青素平均聚合度，該法需要與質(zhì)譜聯(lián)用，操作復(fù)雜，并且由于水解不完全導(dǎo)致與實(shí)際聚合度的偏差。前兩個方法操作較復(fù)雜，測定時間長，同時也受到標(biāo)準(zhǔn)品的限制，該法不易推廣。有研究表明：原花青素在乙酸體系中僅末端黃烷－3－醇參與香草醛反應(yīng)，而在甲醇溶劑體系中各黃烷－3－醇均參與反應(yīng)[3]，根據(jù)此原理可建立測定原花青素物質(zhì)的量的方法。

本研究在香草醛－硫酸（甲醇體系）測定原花青素質(zhì)量的基礎(chǔ)上，研究原花青素物質(zhì)的量測定方法，優(yōu)化反應(yīng)體系各反應(yīng)條件，建立一種快速分析原花青素聚合度的方法，并對該方法進(jìn)行評價及驗(yàn)證性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

兒茶素（純度＞98%）：美國sigma試劑公司；原花青素（純度＞95%）：天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司、浙江森宇天然產(chǎn)物有限公司；原花青素B2（純度＞98%）：天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；香草醛、乙酸、甲醇、鹽酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV5200紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：廣東環(huán)凱儀器有限公司；WND－200型高速中藥粉碎機(jī)：浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司；RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 原花青素物質(zhì)的量濃度曲線建立及方法評估

采用香草醛比色法測定原花青素物質(zhì)的量濃度。具體反應(yīng)條件：配制0.016 g/L～0.080 g/L（+）－兒茶素－乙酸溶液、含4%（體積分?jǐn)?shù)）鹽酸0.5 g/100 mL香草醛－乙酸溶液，避光反應(yīng)一定時間后于400 nm～600 nm范圍內(nèi)掃描，測定最大吸收波長。

考察不同反應(yīng)條件（試劑體積比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間）對吸光值的影響，確定最佳反應(yīng)條件，繪制原花青素物質(zhì)的量濃度－吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、檢出限及回收率進(jìn)行計(jì)算與分析。

1.2.2 樣品聚合度的計(jì)算

通過對不同已知聚合度原花青素進(jìn)行測定與分析，考察該方法的適用性。采用上述1.2.1方法測定原花青素的物質(zhì)的量濃度，結(jié)合香草醛－硫酸法[8]測定原花青素質(zhì)量可計(jì)算原花青素聚合度（DP），聚合度計(jì)算公式如下：

式中：cg為原花青素質(zhì)量濃度，g/L；cn為原花青素物質(zhì)的量濃度，moL/L；M為（+）－兒茶素摩爾質(zhì)量，290 g/moL。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的選擇

原花青素與香草醛反應(yīng)產(chǎn)物在光照條件下不穩(wěn)定，因此反應(yīng)和測定時需在避光條件下進(jìn)行。

2.1.1 最大吸收波長

在1 mL兒茶素－乙酸溶液（濃度0.05 mol/L）加入5 mL香草醛－乙酸溶液，室溫避光下反應(yīng)5 min后在400 nm～600 nm范圍內(nèi)掃描，以最大吸收波長作為檢測波長見圖1。

圖1 檢測波長-吸光值曲線Fig.1 Detection wavelength-absorbance curve

由圖1可知，以乙酸為溶劑時，產(chǎn)物的最大吸收波長為500 nm。確定檢測原花青素物質(zhì)的量濃度波長為500 nm。

2.1.2 體積比的確定

為了確保試樣中原花青素與香草醛反應(yīng)完全，對檢測過程中所需的香草醛溶液與待測樣品體積比對吸光值的影響進(jìn)行研究，即在1 mL兒茶素溶液中分別按體積比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10加入香草醛－乙酸溶液，室溫下避光反應(yīng)5 min，測定500 nm下的吸光值，并轉(zhuǎn)化為單位體積反應(yīng)溶液的吸光度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 體積比-吸光值曲線Fig.2 Volume-absorbance value curve

由圖2可看出，香草醛與試樣體積比對反應(yīng)吸光值影響較大，隨著香草醛體積的增加，吸光值增加，當(dāng)在樣品與香草醛體積比為1∶5時，繼續(xù)增加香草醛吸光值不再增加，此時原花青素與香草醛反應(yīng)基本完全。因此樣品溶液與香草醛試劑的最佳體積為1∶5。

2.1.3 反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間的確定

考察不同反應(yīng)溫度（20、25、30、35、40、50℃）及不同反應(yīng)時間（1 min～20 min）對吸光值的影響，確定最佳反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度與時間-吸光值曲線Fig.3 The reaction temperature and time-absorbance value curve

由上圖3可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，吸光值逐漸降低，并隨反應(yīng)時間的延長有所降低。其中在20℃反應(yīng)條件下，樣品吸光值在20 min內(nèi)較穩(wěn)定且反應(yīng)較完全，因此選擇反應(yīng)溫度為20℃。從時間曲線可看出在較短時間內(nèi)（5 min～7 min）酚醛縮合反應(yīng)較完全，之后吸光值有所降低。確定香草醛與試樣反應(yīng)時間為6 min。

2.2 方法評價

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

在2.1.1～2.1.3單因素試驗(yàn)最佳條件下繪制原花青素物質(zhì)的量濃度－吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。

從圖4可看出在500 nm處吸光度x與物質(zhì)的量濃度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程y=0.172x+ 0.000 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。其中，x為吸光度，y為物質(zhì)的量濃度（μmol/mL），其線性范圍為0.055 μmol/mL～0.275 8 μmol/mL，計(jì)算的檢出限為LOD=3Σ/s=2.912× 10－4μmol/mL，說明該方法的靈敏度高。

2.2.2 精密度

圖4 原花青素物質(zhì)的量濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The amount of substance concentration of proanthocyanidins-absorbance value of the standard curve

取兩種不同濃度的樣品溶液分別平行測定5次進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果見表1。不同濃度樣品的RSD（平均標(biāo)準(zhǔn)偏差）均小于1.0%，說明本法重現(xiàn)性好，符合測定要求。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision test results

2.2.3 回收率

取原花青素待測樣品溶液1 mL（物質(zhì)的量為0.032 μmol）各5份，分別加入0.010、0.020、0.040、0.08 μmol的（+）－兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，測定物質(zhì)的量以及計(jì)算回收率，回收率計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery test results

由表2可知，該法測定原花青素物質(zhì)的量濃度線性范圍較寬，原花青素回收率（回收率/%=（加標(biāo)試樣測定值－試樣測定值）/加標(biāo)量×100）在95%～100%的理想范圍內(nèi)，說明本法準(zhǔn)確性高。

2.3 樣品聚合度

通過不同已知聚合度范圍原花青素為參考，測定其物質(zhì)的量計(jì)算并計(jì)算出聚合度進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果見表3。

表3 不同原花青素聚合度分析Table 3 Analysis of polymerization degree of different procyanidins

由表3可知，對不同原花青素（已知聚合度范圍）通過2.2.1方法膠進(jìn)行聚合度測定，試驗(yàn)結(jié)果表明該法重現(xiàn)性良好，適用于聚合度10以內(nèi)的原花青素聚合度的測定與分析。

3 討論

本方法確定原花青素物質(zhì)的量測定方法，結(jié)合原花青素質(zhì)量測定方法分析其聚合度。通過已知聚合度范圍原花青素為參考依據(jù)驗(yàn)證該方法的適用性，試驗(yàn)結(jié)果顯示該法適用于不同聚合度（2～10）原花青素及原花青素混合物聚合度的分析；值得說明的是，對于原花青素混合物，該法分析得到的聚合度為原花青素平均聚合度；對于純度不高的原花青素，分析其聚合度為樣品中原花青素的平均聚合度，雜質(zhì)對其無影響。綜上所述該法簡單易行、重現(xiàn)性良好，適用于不同原花青素聚合度的分析。

[1]孫蕓,谷文英.葡萄籽原花青素聚合度與功效關(guān)系的研究[D].無錫:江南大學(xué),2004

[2] 趙丹,曾新安,徐中岳.不同聚合度葡萄皮原花青素的抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(4):104－107

[3] Larry G Butler,Martin L Price,Jeffery E Brothertod.Vanillin Assay for Proanthocyanidins(Condensed Tannins):Modification of the Solvent for Estimation of the Degree of Polymerization[J].Agric Food Chem,1982,30:1087－1089

[4]任其龍,魏冠紅,金米聰,等.反相高效液相色譜－電噴霧質(zhì)譜法鑒定葡萄籽低聚原花青素[J].食品與發(fā)酵工藝,2006,32(3):79－83

[5]張佰清,閆冬雪.薄層及凝膠色譜法測定樹莓籽原花青素的平均聚合度[J].食品工業(yè)科技,2013,34(11):317－319

[6] James A Kennedy,Graham P Jones.Analysis of proanthocyanidin cleavage products following acid－catalysis in the presence ofexcess phloroglucinol[J].J Agric Food Chem,2001,49(4):1740－1746

[7] 張晶瑩,胡文效,高德艷,等.葡萄籽原花青素檢測方法的比較[J].中外葡萄與葡萄酒,2013(6):18－20

Study on Analytical Methods of Grape Seed Proanthocyanidins Polymerization Degree

GAO De－yan，LIANG Hong－min，REN Ji－bo，ZHANG Jing－ying，HU Wen－xiao*
（Shandong Academy of Grape，Jinan 250100，Shandong，China）

This paper optimized the amount of substance concentration of grape seed proanthocyanidins measurement method to determine the colorimetric condition，a standard curve was established.The amount of substance concentration of proanthocyanidins measurement conditions，establish a standard curve，the standard curve range 0.055 μmol/mL－0.275 8 μmol/mL，the detection limit was 2.912×10－4μmol/mL，the recoveries of 95%－100%，precision of RSD was 0.757 1%；test verified by measuring different degree of polymerization of proanthocyanidins，the results confirmed that the method of high sensitivity and good reproducibility.The method was suitable for the analysis different DP of proanthocyanidins.

procyanidins；the degree of polymerization；grape seed

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.029

2016－08－25

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目

高德艷（1988—），女（漢），碩士，主要從事生物活性成分活性分離、活性評價等方向研究。

*通信作者：胡文效，男，研究員，研究方向：生物化工專業(yè)生物分離方向、食品科學(xué)與工程專業(yè)葡萄與葡萄酒方向。