陶麗婷+楊世鵬+王麗慧+李屹+李莉

摘要：為快速有效地確定辣椒疫霉菌SSR-PCR反應(yīng)體系，采用正交優(yōu)化設(shè)計(jì)方法，對(duì)影響辣椒疫霉菌SSR-PCR反應(yīng)體系的4個(gè)主要因素（模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶）在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，不同因素下各水平濃度對(duì)SSR-PCR的反應(yīng)結(jié)果均有顯著性影響，最佳反應(yīng)體系（20 μL）為：1.0 ng模板DNA，0.8 μmol/L引物，0.5 μmol/L dNTPs，1.0 U Taq酶。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，58.4 ℃退火30 s，36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 2 min，最佳循環(huán)數(shù)為36。利用該體系對(duì)12份辣椒疫霉菌進(jìn)行驗(yàn)證，證明該體系穩(wěn)定可靠，本試驗(yàn)為辣椒疫霉菌遺傳多樣性分析研究及分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒疫霉菌；SSR-PCR；正交設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S436.418文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0080-04

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）是引起辣椒疫病的霜霉屬真菌，危害作物根、莖、葉，卵孢子可在土壤中越冬。由于疫病是土傳病害，傳播速度快、途徑廣，給辣椒生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，種植抗病品種是防治辣椒疫病的有效方法之一，然而，辣椒疫霉菌具有很高的變異性[2]，基于SSR標(biāo)記具有位點(diǎn)多態(tài)性高的特點(diǎn)，可以揭示這些變異并發(fā)現(xiàn)不同種間的多態(tài)性[3]。因此，對(duì)辣椒疫霉菌遺傳多樣性的深入研究對(duì)辣椒抗病育種及群體結(jié)構(gòu)分析具有重要意義。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）是以1～6個(gè)核苷酸多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列[4]，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、對(duì)DNA質(zhì)量要求不高且重復(fù)性好、可靠性高等特點(diǎn)[5]。SSR位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)基因及基因組的遺傳變異具有重要作用，可用于研究真菌種群的遺傳結(jié)構(gòu)多樣性[6]，但相關(guān)疫霉菌的報(bào)道較少[7]。藺宇等通過對(duì)大豆疫霉菌EST開發(fā)新的SSR標(biāo)記，來研究大豆疫霉菌的遺傳變異[8]。孫文秀等對(duì)7個(gè)不同區(qū)域的辣椒疫霉菌進(jìn)行RAPD分析，探索了不同區(qū)域辣椒疫霉菌的遺傳分化關(guān)系[9]。姚國勝等用SSR對(duì)馬鈴薯致病疫霉群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并完善了其分子標(biāo)記體系[10]。

本研究對(duì)Taq酶、模板DNA、dNTP、引物等4個(gè)因素，在4個(gè)不同濃度水平下進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行擴(kuò)增體系的優(yōu)化，并對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化， 以期確定辣椒疫霉菌SSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系，為后續(xù)群體遺傳多樣性分析等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本試驗(yàn)所用材料為青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所采集的來自青海省海東市樂都區(qū)、循化縣、大通縣、互助縣、貴德縣等5個(gè)地區(qū)的12株辣椒疫霉菌。菌株信息如表1所示。

試驗(yàn)所用Taq酶、dNTPs、DNA Marker（D2000）、Mg2+、10×PCR buffer均購自天根生化科技（北京）有限公司。SSR引物根據(jù)GeneBank所公布的辣椒疫霉菌全序列基因，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)而成，引物由北京華大基因有限公司合成。

核酸檢測(cè)儀（2000C，購自Thermo）；PCR儀（Eppendorf Mastercycler pro，購自上海研域儀器設(shè)備有限公司）；電泳儀（DYY-6C型，購自北京市六一儀器廠）；凝膠成像儀（ImageQuant300/350/RTECL，購自Bio-RAD）。

1.2基因組DNA提取與檢測(cè)

采用生工UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取辣椒疫霉菌基因組DNA。用核酸檢測(cè)儀確定DNA濃度與純度，并將樣品DNA稀釋到所需濃度，用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果，并在凝膠成像儀上分析與拍照，最后于-80 ℃保存。

1.3PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)

以采集自青海省海東市樂都區(qū)的辣椒疫霉菌（LL04）為試驗(yàn)材料，BJP05號(hào)引物（5′-3′：GACTCGGACTCGGACGAC，3′-5′：CTCCTGCTCATCTTTCAGGC）為試驗(yàn)引物，SSR-PCR反應(yīng)體系的4個(gè)因素分別為模板DNA、dNTPs、引物、Taq酶的濃度，采用L16（44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素4水平篩選分析，方案如表2、表3所示。設(shè)試驗(yàn)總體系為20 μL，按照表2中要求加入，另加4 μL 10×PCR buffer、2 μL Mg2+，用ddH2O補(bǔ)足 20 μL。SSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，58.4 ℃退火30 s，36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 2 min，4 ℃保存。所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加5 μL 6×Loading buffer，充分混勻后，取10 μL在1%瓊脂糖凝膠上120 V恒壓下電泳30 min，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀測(cè)拍照。

1.4正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)參照申潔等的方法[11]，統(tǒng)計(jì)可識(shí)別條帶，同時(shí)參考條帶明亮程度及背景清晰度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用極差、方差和多重比較方法分析各個(gè)處理結(jié)果，結(jié)果如表4所示。

1.5退火溫度優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系中，每對(duì)引物都有其最適宜的退火溫度。對(duì)同一模板、引物，設(shè)退火溫度梯度進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以引物的參考退火溫度±4 ℃上下浮動(dòng)[12]，以期獲得該反應(yīng)體系下最佳退火溫度。依據(jù)上述試驗(yàn)的最優(yōu)反應(yīng)體系對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。采用梯度PCR模式，自動(dòng)設(shè)定溫度為54.4～61.4 ℃，生成溫度梯度54.4、55.6、56.4、57.2、58.4、59.0、60.5、61.2 ℃。其他反應(yīng)程序與PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增程序相同。

1.6擴(kuò)增體系穩(wěn)定性驗(yàn)證

利用優(yōu)化的體系，以BJP05號(hào)引物隨機(jī)選取12份辣椒疫霉菌DNA模板分別進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行辣椒疫霉菌SSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取與檢測(cè)

本試驗(yàn)利用生工真菌基因組DNA抽提試劑盒提取12份辣椒疫霉菌模板DNA，用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)模板DNA濃度及純度，其D260 nm/D280 nm值在1.80～1.92之間，DNA濃度平均為320 ng/μL，加ddH2O稀釋至所需濃度，-80 ℃保存。

2.2SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用正交優(yōu)化設(shè)計(jì)L16（44），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，16個(gè)處理結(jié)果均有條帶出現(xiàn)。從圖1可以看出，4個(gè)因素在不同水平處理下其擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。處理2、6、9、10、11、13、15的擴(kuò)增條帶數(shù)多且清晰，其中9、10、11處理主條帶較明顯，因此可認(rèn)為這3個(gè)組合——9（A3B1C3D4）、10（A3B2C4D3）、11（A3B3C1D2）是16個(gè)正交試驗(yàn)處理中較適合辣椒疫霉菌SSR-PCR擴(kuò)增的組合。2.3正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

組合9、10、11是16個(gè)正交試驗(yàn)處理中較優(yōu)的組合，根據(jù)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)各因素進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以確定最佳組合。極差越大，離散程度越大，也說明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大[13-14]。由表4可知，影響辣椒疫霉菌SSR-PCR反應(yīng)體系的4個(gè)因子中，模板DNA濃度影響最大，其次是引物濃度，再次是Taq酶濃度，影響最小的是dNTPs濃度。由此判斷出，SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果特異性條帶多且亮的3個(gè)組合中最優(yōu)的反應(yīng)體系是組合11（A3B3C1D2）。

為驗(yàn)證以上結(jié)果，對(duì)表4中各組合下擴(kuò)增片段數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示，4因素F值的大小順序?yàn)槟０錎NA>引物>Taq酶>dNTPs，說明模板DNA濃度對(duì)辣椒疫霉菌SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響最大，其次是引物濃度和Taq酶濃度，dNTPs濃度對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果影響最小。其中，模板DNA、引物、Taq酶各濃度水平對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果均有顯著性差異，且模板DNA各水平對(duì)擴(kuò)增結(jié)果具有極顯著性差異。方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致，則證明正交優(yōu)化設(shè)計(jì)表中第11組處理是辣椒疫霉菌SSR-PCR反應(yīng)體系的最優(yōu)處理，即影響辣椒疫霉菌SSR-PCR反應(yīng)體系的4因素最佳濃度水平分別為1.0 ng模板DNA、0.8 μmol/L引物、0.5 μmol/L dNTPs、1.0 U Taq酶。

2.4PCR退火溫度篩選

PCR反應(yīng)中，退火溫度可能直接影響模板與引物的特異性結(jié)合。如圖2所示，8個(gè)退火溫度下均可擴(kuò)增出特異性條帶，在退火溫度低時(shí)，非特異性條帶增多，且條帶模糊不清晰，在退火溫度高時(shí)，條帶較暗。第1、2、3退火溫度處理?xiàng)l帶擴(kuò)增彌散嚴(yán)重，背景較深，出現(xiàn)非特異性條帶且主帶亮度較弱；隨著退火溫度的升高，第6、7、8退火溫度處理?xiàng)l帶彌散減少，擴(kuò)增不穩(wěn)定且主帶缺失；當(dāng)退火溫度為57.2～58.4 ℃時(shí)， 擴(kuò)增條帶清晰，重復(fù)性好且主條帶亮，但以58.4 ℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳。因此確定該引物的最佳退火溫度為58.4 ℃。

2.5SSR-PCR最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

采用上述最佳反應(yīng)體系結(jié)果，用BJP05號(hào)引物，對(duì)來自青海省海東市樂都區(qū)、互助縣、大通縣、循化縣、貴德縣的12份辣椒疫霉菌DNA進(jìn)行SSR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3所示，引物對(duì)每份DNA樣品均擴(kuò)增出清晰的、多態(tài)性高且重復(fù)性好的目的條帶，說明該體系穩(wěn)定性較好，適用于辣椒疫霉菌的SSR反應(yīng)。

3討論

由于SSR標(biāo)記易受到反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序的影響，且各因素間又存在互作效應(yīng)[15]，因此確定辣椒疫霉菌SSR-PCR最佳反應(yīng)體系能夠迅速獲得試驗(yàn)結(jié)果，為辣椒疫霉菌遺傳多樣性研究的順利進(jìn)行節(jié)省時(shí)間與成本[16]。本試驗(yàn)采用 L16（44） 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確立最佳組合，通過方差分析確定各個(gè)因素在4個(gè)濃度水平下對(duì)SSR-PCR反應(yīng)影響的大小。

在PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系中，影響PCR結(jié)果的5個(gè)因素為Taq酶、Mg2+、DNA、dNTPs、引物。Mg2+是影響PCR結(jié)果的重要變量之一，高濃度的Mg2+，使非特異性條帶增多，濃度過低，影響酶活性。在前人研究中，Mg2+的用量浮動(dòng)不大[17]，其濃度在1.5～2.0 μmol/L之間浮動(dòng)，本試驗(yàn)在20 μL體系中加2 μL Mg2+，使其終濃度保持在分子克隆標(biāo)準(zhǔn)體系的較低水平，因此，本試驗(yàn)未對(duì)Mg2+濃度作相關(guān)分析。dNTPs是PCR反應(yīng)的底物[18]，高濃度的dNTPs會(huì)與酶競(jìng)爭(zhēng)游離的Mg2+，降低其活性，引起錯(cuò)配，低濃度則會(huì)影響擴(kuò)增效率。Taq酶是對(duì)Mg2+依賴的酶，濃度過高產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，濃度過低會(huì)引起反應(yīng)靈敏度差，使條帶彌散。DNA是PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)，前人研究認(rèn)為DNA的波動(dòng)范圍較廣，其濃度在 1.0～6.0 ng/μL之間對(duì)反應(yīng)影響不大[19]。DNA濃度過高使模板之間配對(duì)概率增加，相對(duì)減少了引物與模板的配對(duì)機(jī)會(huì)，降低引發(fā)效率，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明模板DNA對(duì)PCR反應(yīng)影響最大，引物、Taq酶次之，dNTP濃度影響最小。退火溫度決定PCR特異性和產(chǎn)量，溫度過高引物不能與模板牢固結(jié)合，過低則容易使引物和模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加?？赏ㄟ^設(shè)置一系列梯度，以確定某些反應(yīng)的特定退火溫度，本試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)梯度，篩選出最佳退火溫度為58.4 ℃。

綜上所述，不同物種對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增體系影響各不相同，因此，采用SSR-PCR的方法研究遺傳多樣性之前對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化是必不可少的，不但減少試驗(yàn)工作量節(jié)省成本，而且將增加對(duì)遺傳多樣性研究的多態(tài)性，提供試驗(yàn)的可重復(fù)性。

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