砷超富集植物蜈蚣草叢枝菌根觀察方法的優(yōu)化

邱丹+杜芮萍+孟德凱+黎寧+顧明華+王學(xué)禮

摘要：為了便于蜈蚣草菌根結(jié)構(gòu)的觀察及侵染狀況的測定，研究根系組織透明（脫色）流程優(yōu)化及采用酸性品紅乳酸液、曲利苯藍(lán)、藍(lán)黑醋酸墨水（北京牌）和純黑醋酸墨水（Quink牌）4種染液處理對菌根染色效果的影響，以優(yōu)化蜈蚣草叢枝菌根觀察的脫色條件及染液染色方法。結(jié)果表明，采用20%KOH于90 ℃水浴60 min、堿性H2O2處理 45 min 的方法對根系的脫色效果最好；采用醋酸墨水染色，菌絲、泡囊、叢枝的染色效果明顯。研究結(jié)果將為觀察蜈蚣草菌根提供技術(shù)指導(dǎo)，方便測定真菌侵染狀況，從而為進(jìn)一步研究叢枝菌根真菌對砷在蜈蚣草體內(nèi)的遷移轉(zhuǎn)化提供方法指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：砷；超富集植物；叢枝菌根；蜈蚣草；共生體系；觀察；優(yōu)化

中圖分類號： Q944.54；Q949.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0236-03

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，簡稱AM）形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察是從事菌根研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作，是后期叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizae fungi，簡稱AMF）鑒定、植物侵染率測定等相關(guān)研究的必經(jīng)環(huán)節(jié)。目前用于菌根觀察的方法主要是染色鏡檢法[1]，其操作簡便、易于觀察，主要步驟為固定、透明、染色、分色、制片和觀察，其中根系透明、染色是關(guān)鍵步驟。一般植物根系采用5%～10%KOH溶液于90 ℃透明處理 20～60 min即可達(dá)到滿意的效果。但不同的植物其根系生長狀況不同，因而KOH濃度及處理時(shí)間也不同。AM染色的方法有多種，目前使用最多的染色液是酸性品紅和曲利苯藍(lán)[1]。

蜈蚣草是一種砷超富集植物[2]，具有極強(qiáng)的吸收砷特性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于砷污染土壤的修復(fù)中[3]，已有在蜈蚣草中發(fā)現(xiàn)叢枝菌根的報(bào)道[4]。AM真菌侵染能提高根際土壤砷酸還原酶的活性，利于砷酸鹽轉(zhuǎn)換為亞砷酸鹽，促進(jìn)砷從蜈蚣草根部轉(zhuǎn)移到地上部，明顯提高蜈蚣草地上部中砷含量，從而提高蜈蚣草的砷修復(fù)效率[5-7]。但是，蜈蚣草根系中單寧含量高[8]，根系木質(zhì)化、偏硬，顏色較深，在菌根觀察過程中不易于根系脫色，對后期染色后的觀察產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。針對此問題已有相關(guān)報(bào)道，如Trotta等采用10% KOH于60 ℃透明處理60 min，并置于室溫下處理1周[8]；劉逸竹采用10% KOH于95 ℃保溫30～60 min[9]；Wu等采用10% KOH于 90 ℃ 處理60 min，并用新配的堿性H2O2處理20～60 min[10]?？傮w來看，不同研究者所采取的方法不同，其觀察效果存在很大不同，且研究結(jié)果間缺乏可比性，這在很大程度上影響了蜈蚣草叢枝菌根的相關(guān)研究。因此本研究旨在通過優(yōu)化蜈蚣草菌根透明條件以及選用不同的染色液來探究蜈蚣草最適的菌根觀察方法，在此基礎(chǔ)上標(biāo)準(zhǔn)化蜈蚣草菌根觀察方法，并為侵染率測定及后續(xù)砷在叢枝菌根-蜈蚣草共生體系中的遷移轉(zhuǎn)化研究提供方法支撐。

1材料與方法

1.1植物材料

供試蜈蚣草于2015年7月采自廣西刁江沿岸金城江區(qū)某地土壤砷污染修復(fù)基地，為大田生長1年的蜈蚣草植株。用自來水輕輕沖洗根系，除去黏著的土壤，得到干凈的根系；用濾紙吸干水分，挑選200 g較嫩的根系，置于50%乙醇溶液中保存，常溫放置備用。

1.2試驗(yàn)試劑

主要試劑：乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純）；HCl（沈陽市新光化工廠，分析純）；KOH（Kermel，分析純）；H2O2（KESHI，分析純）；氨水[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，分析純]。染色劑：酸性品紅（CHEMICAL）；曲利苯藍(lán)（天津博迪化工股份有限公司，分析純）；藍(lán)黑醋酸墨水（北京牌）；純黑醋酸墨水[Quink（派克）牌]。

1.3組織透明及染色

1.3.1組織透明（脫色）取15支5 mL玻璃試管，編號1～15，分為3組，將根系剪成小段（1 cm左右）后均分置于試管中，分別向1～5、6～10、11～15號試管中加入10%、15%、20%KOH溶液，置于90 ℃水浴鍋中水浴60 min，隨后每組分別進(jìn)行以下處理：室溫下過夜（CK），用堿性H2O2處理30、45、60 min。

1.3.2漂洗將溶液倒掉，待試管冷卻后用清水將根段沖洗3次。

1.3.3酸化向試管中加入2% HCl，對根段進(jìn)行酸化，以促進(jìn)染色，5 min后將HCl倒掉。

1.3.4染色將每支試管的根均分為3組，每組分別用 0.1 g/L 酸性品紅乳酸液（1 L溶液中含874 mL乳酸、63 mL甘油、63 mL去離子水、0.1 g酸性品紅）、曲利苯藍(lán)染色液（1 L 溶液中含300 mL乳酸、300 mL甘油、0.65 g曲利苯藍(lán)）、5%醋酸墨水溶液（含95 mL食醋、5 mL北京牌藍(lán)黑墨水）、5%醋酸墨水溶液（含95 mL食醋、5 mL派克墨水）染色，于90 ℃染色 20 min。

1.3.5分色將染色后的根段用清水清洗3～4次后，清水浸泡過夜。

1.4制片與顯微觀察

挑取透明染色后的根段，用清水作浮載劑固定在載玻片上，每片平行擺放10條根段，壓片后置于生物學(xué)顯微鏡（尼康，型號NI-U）下觀察及拍照。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理對菌根脫色的影響

菌根觀察的關(guān)鍵步驟在于細(xì)胞組織脫色透明，本研究采用不同濃度KOH對菌根進(jìn)行脫色處理。由圖1可見，10%、15%、20%3個(gè)KOH濃度處理的脫色效果均不理想，但是隨著KOH濃度的提高，脫色效果逐步提升，3個(gè)處理中以20%KOH處理的效果最好，但仍然無法完全去除蜈蚣草根系自身所帶的顏色，在一定程度上影響了觀察效果。

在上述處理的基礎(chǔ)上，通過過夜和添加堿性H2O2來強(qiáng)化脫色效果。由圖2可見，不添加H2O2直接過夜的對照處理效果最差；添加H2O2能顯著提高脫色效果；隨著處理時(shí)間的延長，脫色效果逐步提高，但堿性H2O2處理時(shí)間過長同樣會導(dǎo)致菌根結(jié)構(gòu)染色效果變差，當(dāng)處理時(shí)間為60 min時(shí)，幼嫩根系細(xì)胞受到破壞，細(xì)胞普遍染上顏色，不易區(qū)分觀察（圖2-D）。因此，在過夜處理，H2O2處理30、45、60 min等4個(gè)方法中，用20%KOH于90 ℃水浴60 min后，再用新配的堿性H2O2處理45 min的方法脫色效果最好（圖2-C），去除了蜈蚣草根系本身帶有的顏色，將細(xì)胞透明化，經(jīng)染色后能清晰地辨別出菌絲、泡囊、叢枝等菌根結(jié)構(gòu)。

2.2不同染色劑對菌根觀察的影響

不同染色劑對菌根的染色效果差別很大，上述脫色步驟已經(jīng)證明，先用20%KOH于90 ℃水浴60 min，再用堿性H2O2處理45 min的方法對蜈蚣草根系脫色效果最好。在染色階段采用的4種染色劑分別是酸性品紅乳酸液、曲利苯藍(lán)染色液、北京牌藍(lán)黑墨水、派克牌純黑墨水。

其中，酸性品紅乳酸液染色后的菌根呈紅色，從圖3-A中可以看出，品紅乳酸液在將蜈蚣草菌根結(jié)構(gòu)染色的同時(shí)，也將根皮層細(xì)胞染上了相同或略淺的顏色，導(dǎo)致反差效果不明顯，并且會持續(xù)褪色，使染上顏色的菌根隨著時(shí)間的推移顏色變淡甚至褪去，即染色效果不穩(wěn)定，這勢必影響菌根的觀察效果。

由圖3-B可見，曲利苯藍(lán)染液染色后的菌根呈藍(lán)色，染色效果可靠穩(wěn)定，能持久保持，但與品紅乳酸液一樣，在將菌根結(jié)構(gòu)染色的同時(shí)也將根皮層細(xì)胞液染上相同或略淺的顏色，反差效果不明顯。

北京牌藍(lán)黑墨水、派克牌純黑墨水2種墨水的染色效果均較好。從圖3-C、圖3-D可以看出，這2種墨水染色后菌根內(nèi)部的菌絲、泡囊等結(jié)構(gòu)清晰可見，且經(jīng)其染色的根皮層基本未染上顏色，反差效果明顯。

3討論

叢枝菌根的觀察是從事菌根研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作。宿主和所采根系的生長狀況，如年齡、粗細(xì)、木質(zhì)化程度不同等均會影響AM的觀察[11]，因此不同植物采用的脫色和染色方法不同。KOH溶液的濃度及其處理時(shí)間會顯著影響根系的透明度和染色效果，對于根系木質(zhì)化較輕的植物如玉米、黃花蒿、三葉草等，采用5%左右的KOH溶液于70～90 ℃透明處理20～30 min即可達(dá)到脫色效果[2]。但是對于蜈蚣草及木本植物如茶樹、蘋果、核桃等，由于其根系木質(zhì)化程度高，而且根系含色素，顏色較深，處理?xiàng)l件不當(dāng)會使根系透明（脫色）不完全，染色后產(chǎn)生干擾，不易觀察[12-13]。本研究通過適當(dāng)提高KOH濃度，延長處理時(shí)間，并用堿性H2O2輔助，達(dá)到了很好的改善透明效果的目的，為下一步染色提供了一定的基礎(chǔ)。

土壤中有很多與AM真菌結(jié)構(gòu)相似的真菌，當(dāng)以AM菌根真菌為目標(biāo)進(jìn)行染色時(shí)，會有其他種類真菌同時(shí)被染色，其中個(gè)別種類真菌的菌絲形態(tài)、著色程度與AM真菌近似，對菌根觀察產(chǎn)生干擾。當(dāng)采用酸性品紅或曲利苯藍(lán)染色時(shí)，很容易與AM真菌混淆[14]，且酸性品紅和曲利苯藍(lán)染色后，在脫色階段，皮層組織與真菌是同步脫色的，當(dāng)皮層組織脫色至無色透明時(shí)，真菌菌絲的形態(tài)亦不再可辨；同時(shí)，兩者都是致癌疑似物，毒性較大，對長期使用者的健康可能有害[15]，建議盡量少采用。采用北京牌墨水、派克牌墨水等醋酸墨水染色時(shí)，菌絲著色牢固，經(jīng)過清水長時(shí)間浸泡脫色后，根皮層組織可視為完全脫色，而真菌的菌絲、泡囊等結(jié)構(gòu)仍然保持鮮明的藍(lán)色，色差明顯，可見可以通過形態(tài)特征的比較，區(qū)分AM真菌與其他真菌[16]。因此，醋酸墨水染色法對于染色和區(qū)分AM真菌與其他真菌更有效，在統(tǒng)計(jì)根系中AM真菌的侵染率時(shí)可以減少誤差。

綜上所述，隨著KOH濃度的提高，蜈蚣草菌根脫色透明的效果逐步提高，在堿性H2O2強(qiáng)化作用下，可達(dá)到理想的效果。就染色效果而言，2種醋酸墨水的染色效果較好，著色穩(wěn)定且清晰，能將菌絲、泡囊等形態(tài)特征區(qū)分開來。因此，綜合考慮蜈蚣草菌根結(jié)構(gòu)觀察的清晰度、反差效果、毒性及成本等方面，建議先用20% KOH于90 ℃水浴60 min，后用堿性H2O2處理45 min的方法進(jìn)行脫色透明處理，再用采用醋酸墨水進(jìn)行染色。

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