李全勝，張國(guó)麗，馬盼盼，武冬梅，高 能，謝宗銘

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所/作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832000）

0 引言

隨著我國(guó)倡導(dǎo)化肥和農(nóng)藥減施增效技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，以及人們對(duì)生態(tài)環(huán)境保護(hù)和食品安全保障的關(guān)注，新型生物農(nóng)藥的開發(fā)和利用得到了進(jìn)一步的發(fā)展。微生物農(nóng)藥作為綠色農(nóng)藥的一種類型，不論在基礎(chǔ)研究還是產(chǎn)業(yè)化方面均走在了整個(gè)生物農(nóng)藥研究領(lǐng)域的前列[1-2]。截止到2016年，我國(guó)微生物農(nóng)藥的產(chǎn)品數(shù)量達(dá)到376個(gè)，有效成分種類為27個(gè)，主要商業(yè)化的細(xì)菌產(chǎn)品有：蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和蠟樣芽孢桿菌（bacillus cereus）[3]。

在微生物農(nóng)藥的菌株資源篩選及其菌劑應(yīng)用方面，芽孢桿菌因具有分布廣、易培養(yǎng)、抗菌譜廣、誘導(dǎo)作物抗病性產(chǎn)生等諸多優(yōu)點(diǎn)以及產(chǎn)高耐性芽孢的獨(dú)特性[4-6]，已經(jīng)成為糧食、油料和蔬菜等各種作物土傳病害防治和促進(jìn)作物生長(zhǎng)的研究熱點(diǎn)。經(jīng)過多年研究和積累，一批具有優(yōu)良防治效果的芽孢桿菌菌株資源和菌劑產(chǎn)品得到發(fā)掘和開發(fā)[7-9]，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)出良好的防效。如，江蘇農(nóng)科院植保所開發(fā)的發(fā)了生物殺菌劑B-916對(duì)紋枯病防效達(dá)75%—85%，對(duì)稻曲病防效達(dá)63.8%—85.7%[10-11]；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)分離篩選獲得的枯草芽孢桿菌B3，商品名為麥豐寧，對(duì)小麥紋枯病田間防效達(dá)50%—80%[12]；張淑梅等研究表明，含有枯草芽孢桿菌B29菌株的生物拌種劑對(duì)大豆根腐病菌（Fxysporum f.sp.vedolens）具有強(qiáng)拮抗作用，苗期的田間防效達(dá)60%以上，同時(shí)能夠顯著提高根系中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性，具有間接誘導(dǎo)大豆抗病性作用[13]。

近年來，隨著綠色有機(jī)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，微生物菌劑受到廣泛關(guān)注，部分產(chǎn)品也進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)，但是真正得到大規(guī)模應(yīng)用于田間作物病害穩(wěn)定防治的種類還很少，主要原因在于田間不可控的因素，如溫度、酸堿以及紫外線等對(duì)生防菌劑中微生物的繁殖、抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生以及防效作用的發(fā)揮影響較大，導(dǎo)致菌劑的田間防治效果不穩(wěn)定[14-15]。本團(tuán)隊(duì)通過前期研究，從新疆石河子多年連作棉田中分離獲得一株本土的鹽堿適應(yīng)性較強(qiáng)的菌株S12，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16 SrDNA基因測(cè)序?qū)⑵滂b定為枯草芽孢桿菌，其對(duì)棉花黃萎病菌的菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)均具有較強(qiáng)的抑制作用[16]，室內(nèi)盆栽生防效果達(dá)到72.18%，為了后續(xù)更好的將其研發(fā)成生防菌劑并規(guī)?；瘧?yīng)用到新疆棉田的土傳病害防治中，本試驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)菌株S12對(duì)棉花幼苗的促生效果以及其拮抗物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，以期為菌株S12防病促生菌劑的生產(chǎn)和保藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與棉種

菌株S12是由本研究室從新疆石河子市多年連作棉田中分離獲得，-80℃超低溫冰箱中甘油保存；棉花黃萎病菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）和新陸早36號(hào)棉種由作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0—7.2。121℃滅菌20min；NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉15g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0—7.2。121℃滅菌20min；NB培養(yǎng)基組成除不加瓊脂粉外，其他成分同NA培養(yǎng)基；察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g、NaNO33 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O0.01 g、蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20min。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液及發(fā)酵濾液的制備

將菌株S12在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，接種于NB培養(yǎng)基中，裝液量為20mL/50 mL，30℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)14h，即得種子發(fā)酵液。取種子發(fā)酵液400uL轉(zhuǎn)接于裝液量為40 mL/100mL的NB培養(yǎng)基中，30℃，200r/min，搖床培養(yǎng)48 h，即得菌株S12發(fā)酵液。取發(fā)酵液20mL裝入50mL離心管，8500r/min離心20min，獲得菌體沉淀和發(fā)酵上清液。菌體沉淀用不同體積的無菌水重懸浮，得到不同稀釋倍數(shù)的菌體懸浮液；上清液經(jīng)孔徑0.22μm濾器過濾后得到菌株S12的發(fā)酵濾液，發(fā)酵濾液經(jīng)不同體積的無菌水稀釋后得到不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵濾液。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定

采用牛津杯法。將活化的棉花黃萎病菌菌餅（直徑5mm）接種至100mL察氏培養(yǎng)基中，26℃，220r/min搖床培養(yǎng)4—6d，用4層紗布除去菌絲，獲得孢子懸浮液，然后用無菌水稀釋濃度至1×105個(gè)/mL，取0.1 mL孢子稀釋液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，然后等距放置4個(gè)牛津杯，向牛津杯中加入菌株S12的無菌發(fā)酵濾液150μL，無菌水作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)4 d，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑[20]。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)特性分析

1.2.3.1 生長(zhǎng)曲線

將菌株S12接入NB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后。按1%接種至裝有50 mL NB培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30℃、180 r/min培養(yǎng)，每2h測(cè)定600nm的吸光值。

1.2.3.2 耐鹽性

取培養(yǎng)14 h的菌液，按1%接種至NaCl濃度分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.4%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9.0%、10.0%NB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)16 h后測(cè)定600 nm的吸光值。

1.2.3.3 耐酸堿性

取培養(yǎng)14 h的菌液，按1%接種至pH分別為4、5、6、7、8、9、10的NB培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)16h后測(cè)定600nm的吸光值。

1.2.3.4 菌株S12的傳代穩(wěn)定性

將菌株S12在NA平板上每隔1 d轉(zhuǎn)板1次，連續(xù)轉(zhuǎn)板10次，將每次轉(zhuǎn)板后的菌株再轉(zhuǎn)接到NB培養(yǎng)基中，獲取發(fā)酵濾液，每個(gè)處理重復(fù)3次，以棉花黃萎病菌為指示菌，牛津杯法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 菌株對(duì)幼苗的影響

挑選飽滿、大小一致的棉花種子，75%乙醇浸泡45s后，無菌水沖洗3次，然后將種子浸于10%H2O2中2h，再用無菌水沖洗3次，將表面殺菌的種子播種于裝有2/3的體積營(yíng)養(yǎng)盒蛭石中。處理1:分別用菌株S12懸浮液（稀釋10、100、1000倍）澆灌，處理2:分別用菌株S12發(fā)酵濾液（稀釋10、20、50倍）澆灌，對(duì)照用無菌水澆灌，每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)盒澆灌量為300mL，然后溫室25—28℃培養(yǎng)。在第9d調(diào)查成苗數(shù)，計(jì)算成苗率并測(cè)量株高和鮮重。

1.2.5 抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

1.2.5.1 溫度影響

取5只試管，每只試管中添加4 mL無菌發(fā)酵濾液，分別在45℃、65℃、85℃、100℃恒溫水浴鍋處理30min，或在121℃高溫滅菌30min。以棉花黃萎病菌為指示菌，牛津杯法測(cè)量不同溫度處理的發(fā)酵濾液的抑菌圈直徑。對(duì)照為原發(fā)酵濾液，每個(gè)處理重復(fù)3次，

1.2.5.2 酸堿影響

取9個(gè)10mL離心管，每只試管中添加5 mL發(fā)酵濾液，在室溫（25℃）下分別調(diào)pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，4℃靜置過夜，再依次調(diào)pH至7.0，對(duì)照為原發(fā)酵濾液，每個(gè)處理重復(fù)3次，抑菌圈直徑測(cè)定同上。

1.2.5.3 紫外線影響

將發(fā)酵濾液置于25W的紫外線燈下，距燈15cm處分別照射處理20、40、60、80、100、120、140、160、180min后，對(duì)照為原發(fā)酵濾液，每個(gè)處理重復(fù)3次，抑菌圈直徑測(cè)定同上。

1.2.5.4 蛋白酶影響

取3個(gè)1 mL離心管，每只試管加入5mL發(fā)酵濾液，然后分別加胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K至酶反應(yīng)終濃度為1mg/mL，在37℃恒溫水浴條件下反應(yīng)1.5h，50℃恒溫水浴1h終止酶反應(yīng)。對(duì)照為原發(fā)酵濾液，每個(gè)處理重復(fù)3次，抑菌圈直徑測(cè)定同上。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用oneway ANOVA（Duncan檢驗(yàn)）比較各處理間的差異顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株S12生長(zhǎng)特性

2.1.1 菌株S12的生長(zhǎng)曲線

菌株S12在30℃，180 r/min條件下，在NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，26 h達(dá)到最大值2.6×108CFU/mL（圖1）。

圖1 菌株S12生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of strain 12

2.1.2 菌株S12的耐鹽堿特性

菌株S12在含10%NaCl和pH 4.5—9.0的NB培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)（圖2、圖3），具有較高的耐鹽性和較廣的酸堿耐受性。這有助于菌株S12在鹽堿性較高的農(nóng)田定殖和繁殖，進(jìn)而更好的發(fā)揮生防效果。

圖2 NaCl對(duì)菌株S12生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effect of NaCl on the growth of strain 12

圖3 pH對(duì)菌株S12生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of pH on the growth of strain 12

2.1.3 菌株S12傳代穩(wěn)定性

將菌株S12連續(xù)轉(zhuǎn)板10次，然后將各代菌株在NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲取發(fā)酵濾液并測(cè)定其對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌活性。從圖4得知，各代菌株S12的抑菌活性較穩(wěn)定，說明菌株S12的傳代次數(shù)對(duì)其抑菌活性無影響，利于生防菌劑的生產(chǎn)和田間的防效的發(fā)揮。

圖4 傳代次數(shù)對(duì)抑菌活性的影響Fig.4 The effect of subculture on antifungal activity

表1 菌株S12對(duì)棉花幼苗生長(zhǎng)的影響Table1 The effect of strain S12 on cotton seedling growth

2.2 菌株S12對(duì)棉花幼苗的影響

由表1可知，稀釋10至1 000倍菌體懸浮液均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，并且100倍效果最佳，處理9 d后，同對(duì)照相比，成苗率顯著提高34.62%（p＜0.05），株高增加3.63%，鮮重顯著增加8.02%（p＜0.05）；稀釋10和20倍發(fā)酵濾液均對(duì)棉花的成苗率、鮮重和株高表現(xiàn)出抑制作用，而50倍則表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用，處理9 d后，同對(duì)照相比，成苗率顯著提高30.77%（p＜0.05），株高增加3.11%，鮮重顯著增加7.63%（p＜0.05）。

2.3 抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性研究

2.3.1 抑菌物質(zhì)對(duì)溫度的穩(wěn)定性

菌株S12的發(fā)酵濾液在45℃和65℃條件下處理30 min，抑菌活性無明顯變化。溫度高于85℃時(shí)，抑菌活性有所下降，為原有活性的93.75%；當(dāng)溫度達(dá)到121℃時(shí)，抑菌活性依然可以達(dá)到原有活性的91.25%。由此可以得知，菌株S12發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)具有較高的耐熱性（圖5）。

圖5 抑菌物質(zhì)對(duì)溫度的穩(wěn)定性Fig.5 Heat stability of antifungal substance

2.3.2 抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性

菌株S12的無菌濾液分別經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理1.5h后抑菌活性略有下降，但不明顯（圖6）；經(jīng)蛋白酶K處理后，抑菌活性較對(duì)照下降13.75%，說明菌株S12產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，而對(duì)蛋白酶K較敏感。

圖6 抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性Fig.6 Proteinase stability of antifungal substance

2.3.3 抑菌物質(zhì)對(duì)紫外線的穩(wěn)定性

紫外線照射不同時(shí)間后，菌株S12發(fā)酵濾液的抑菌活性與對(duì)照相比無明顯變化，說明發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)對(duì)紫外線穩(wěn)定，耐光照射（圖7）。

圖7 抑菌物質(zhì)對(duì)紫外線的穩(wěn)定性Fig.7 Ultraviolet radiation stability of antifungal substance

2.3.4 抑菌物質(zhì)對(duì)酸堿的穩(wěn)定性

菌株S12發(fā)酵濾液在中性條件pH 7.0時(shí)抑菌活性最大，為原有活性的108.75%；在酸性（pH 4—6）和堿性（pH 8—10）條件下，抑菌活性同原有活性相比無顯著差異（p＜0.05）；其中，在pH 4時(shí)抑菌活性為原有活性的91.25%（圖8）。說明該菌株發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)具有較好的酸堿適應(yīng)性。

圖8 抑菌物質(zhì)對(duì)酸堿的穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of antifungal substance

2.3.5 抑菌物質(zhì)貯藏穩(wěn)定性

菌株S12發(fā)酵濾液在4℃和室溫（20—25℃）下貯藏30 d后，發(fā)酵濾液的抑菌活性無顯著性差異（p＜0.05）（圖9）。表明菌株S12產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較好的耐貯藏性，其貯藏時(shí)間可以達(dá)到1個(gè)月以上。

圖9 抑菌物質(zhì)貯藏穩(wěn)定性Fig.9 Storage time stability of antifungal substance

3 討論

相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥，生物農(nóng)藥因具有環(huán)境友好、食品安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[2]，符合農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的要求而不斷創(chuàng)制和利用。其中微生物源農(nóng)藥經(jīng)過國(guó)內(nèi)外學(xué)者多年的研究，已經(jīng)積累了成熟的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)和大量的產(chǎn)品，尤其是芽孢桿菌類產(chǎn)品已進(jìn)入了成熟的商品化階段[3]。但是由于微生物農(nóng)藥的主要成分生防菌株為活體微生物，其在田間的定殖和生長(zhǎng)易受到土壤及環(huán)境因子如溫濕度、pH、紫外線等的影響[17]，因此微生物農(nóng)藥產(chǎn)品在我國(guó)不同地區(qū)發(fā)揮的防效并不一致。

新疆地處歐亞大陸腹地，降雨量少，蒸發(fā)量大，紫外線強(qiáng)烈，是我國(guó)最為干旱、土壤鹽堿化分布最廣的地區(qū)[18]。隨著連作年限延長(zhǎng)，新疆棉田黃萎病的發(fā)生日趨嚴(yán)重。因此，要想研制能在新疆棉田應(yīng)用且發(fā)揮高效防效的生物農(nóng)藥，就必須篩選獲得具有耐鹽堿能力的芽孢桿菌菌株資源。王娜等篩選獲得的生防芽孢桿菌S6培養(yǎng)2 h可達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，30 h后達(dá)到穩(wěn)定期，適合生長(zhǎng)pH為6—8，對(duì)NaCl的耐受能力達(dá)到10%[19]。周小江等篩選獲得的兩株海洋芽孢桿菌對(duì)NaCl的耐受力達(dá)到30%，在防治番茄灰霉病的同時(shí)，提高了番茄的抗鹽能力[20]。本研究篩選的菌株S12培養(yǎng)2 h也可達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，18 h達(dá)到穩(wěn)定期，并且在含10%NaCl和pH 4.5—9.0的NB培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，而且菌株傳代10次后抑菌活性仍然穩(wěn)定；相比較菌株S6，菌株S12表現(xiàn)出更快的生長(zhǎng)速度和更廣的酸堿耐受性，這更加有助于菌株S12在新疆棉田中定殖和繁殖，進(jìn)而更好抑制棉花黃萎病病菌的生長(zhǎng)，提高棉花的抗鹽能力，發(fā)揮防病作用。

研究表明，芽孢桿菌在產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的同時(shí)，還可以產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的因子，例如嗜鐵素、植物激素及揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)等，此外有些菌株還具有溶磷、固氮活性，在防病的同時(shí)還具有促生功能[21-22]。暢濤等研究表明，莫海威芽孢桿菌ZA1具有固氮和分泌IAA的能力，與馬鈴薯拌種后，能夠促進(jìn)其根、莖的長(zhǎng)度和干重[23]。陶晶等研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌組合BCL-8處理番茄后，通過提高番茄對(duì)有機(jī)物質(zhì)的利用率提高了其出苗率、株高和鮮重[24]。易有金等研究枯草芽孢桿菌通過產(chǎn)生吲哚乙酸和赤霉素提高了根長(zhǎng)、株高、葉長(zhǎng)、葉寬和鮮重[25]。本研究也表明，菌株S12懸浮液和稀釋50倍發(fā)酵濾液均能促進(jìn)棉花成苗率、株高和鮮重，這可能與其代謝物質(zhì)中產(chǎn)生的促生長(zhǎng)因子有關(guān)，具體是哪一類物質(zhì)，還需進(jìn)一步研究分析。

生防芽孢桿菌主要通過產(chǎn)生脂肽類抗生素和細(xì)胞壁降解酶等抑菌活性物質(zhì)來抑制作物真菌病原菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而達(dá)到防治植物病害的目的[26]。而在微生物農(nóng)藥加工、儲(chǔ)藏和使用的過程中，溫度的高低、光照的強(qiáng)弱、酸堿的大小以及時(shí)間的長(zhǎng)短，都會(huì)影響其在田間效應(yīng)的發(fā)揮[27]。因此，即使篩選獲得了生防效果良好的菌株，也可能因抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性差而無法應(yīng)用到田間的病害防治。本研究結(jié)果表明，菌株S12抑菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的耐熱性和酸堿適應(yīng)性，且對(duì)紫外線、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，以上均說明S12發(fā)酵濾液中抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性較好。在酸性（pH 2—6）和堿性（pH 9—10）條件下，菌株S12抑菌活性同中性條件相比均呈現(xiàn)顯著下降（p＜0.05），但酸性條件下抑菌活性均低于堿性條件，說明菌株S12發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)在中性和弱堿性條件下能更好的發(fā)揮其抑菌作用。前期研究表明，S12主要產(chǎn)生脂肽類抑菌物質(zhì)[16]，此類物質(zhì)在酸性條件下易沉淀析出，這可能是酸性條件下拮抗活性下降的主要原因。

4 結(jié)論

根據(jù)枯草芽孢桿菌S12對(duì)棉花幼苗的影響及其抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性的分析，獲得以下結(jié)論：（1）菌株S12具有較好的耐鹽堿性，適合在新疆滴灌棉田定殖和繁殖；（2）菌株S12經(jīng)多次傳代后抑菌活性較穩(wěn)定，期抑菌物質(zhì)也具有較強(qiáng)的耐熱性、酸堿適應(yīng)性和儲(chǔ)藏性，利于生物菌劑的生產(chǎn)和儲(chǔ)藏；（3）菌株S12懸浮液和稀釋50倍發(fā)酵濾液可以提高棉苗的成活率，增加植株的鮮重和株高，說明該菌株對(duì)棉花具有促生長(zhǎng)的功能。

References

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