余 麗 晏愛芬 王朝芳

（保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南保山678000）

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為“藥食同源，食藥兼有”。美味牛肝菌不僅具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有較高的藥用價(jià)值。牛肝菌最早記載于古文獻(xiàn)《滇南本草》中：氣味微酸、辛，性平。主治清熱解煩，養(yǎng)血和中?，F(xiàn)代文獻(xiàn)《中國(guó)藥用真菌》《中國(guó)藥用孢子植物》及《秦嶺巴山天然藥物志》中均提到該菌含有的多種生物堿可治腰腿疼痛、手足麻木、盤骨不舒、四肢抽搐以及婦女白帶異常等癥[1-3]。牛肝菌是一類珍稀大型菌根食用真菌，肉厚而細(xì)軟、味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、多糖、纖維素、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，是我國(guó)重要的出口野生食用菌[3]。但野生菌受季節(jié)限制，不能常年為人們供應(yīng)。目前商業(yè)貿(mào)易的美味牛肝菌全部來(lái)自于森林中采集的野生資源，世界各國(guó)都投入了大量的人力、物力和財(cái)力開展對(duì)其引種馴化和人工栽培方法的研究，但均沒有獲得子實(shí)體[4-5]。因此進(jìn)行菌絲分離研究，實(shí)現(xiàn)人工栽培具有重要研究及應(yīng)用的價(jià)值。研究通過(guò)對(duì)保山野生美味牛肝菌菌絲的分離培養(yǎng)，以期為美味牛肝菌的人工馴化提供基礎(chǔ)。

圖1 美網(wǎng)柄牛肝菌

1 材料與方法

1.1材料美網(wǎng)柄牛肝菌（Boletus reticulatus）別名白牛肝菌、大腳菇，圖1，購(gòu)買于保山市場(chǎng)。

1.2培養(yǎng)基①蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，KH2PO41 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；②玉米粉培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，玉米粉50 g，瓊脂20 g，硫酸鎂 1 g，磷酸氫二鉀 1 g，硫酸鈣 1 g，H2O 1000 mL；③改良PDA：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；④胡蘿卜培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；⑤PDA：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 200 g，瓊脂 20 g，H2O 1000 mL；⑥馬鈴薯培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，硫酸鎂 1.5 g，KH2PO41 g，酵母膏 2 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL；⑦黃豆粉培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，KH2PO41 g，酵母膏 7 g，黃豆粉 3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.5 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL。

1.3接種培養(yǎng)材料處理：挑選新鮮、壯實(shí)、無(wú)蟲害的野生子實(shí)體，去掉雜質(zhì)后放置1～2 h，使菇體失去多余的水分，便于分離成功。

母種分離：用75%的酒精對(duì)菇體表面進(jìn)行消毒。無(wú)菌條件下，以組織分離方法進(jìn)行牛肝菌母種分離。將子實(shí)體縱剖為兩半，用解剖刀分別切取野生美味牛肝菌菌柄最下部（接近菌根的地方）、菌柄中部、菌蓋處、菌蓋與菌柄交接處5個(gè)部位組織塊分別放于上述5種培養(yǎng)基中，盡可能將組織塊接入較多的斜面培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為28℃，無(wú)光照。4 d后開始觀察記錄，若有污染則及時(shí)剔除。

1.4菌絲生長(zhǎng)觀察待接種的組織塊長(zhǎng)出較多菌絲時(shí)用接種針挑取少量菌絲接種到七種培養(yǎng)基中28℃純化培養(yǎng)，每?jī)商煊^察一次，并記錄其生長(zhǎng)情況。通過(guò)菌落直徑比較、菌絲生長(zhǎng)比較，分析不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。以確定下一步菌絲培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基。

菌絲的純化：選取經(jīng)過(guò)純化培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀況良好的菌絲接種到適合菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每?jī)商煊^察一次，并進(jìn)行記錄。

1.5菌種鑒定通過(guò)菌絲形態(tài)觀察、研磨菌絲組織的氣味對(duì)所分離的菌絲進(jìn)行初步判斷。在此基礎(chǔ)上提取菌絲DNA進(jìn)行ITS（Internal Transcribed Spacer）鑒定[6-7]，對(duì)分離所得美味牛肝菌菌絲進(jìn)行種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1美味牛肝菌菌絲分離情況不同分離培養(yǎng)基的分離結(jié)果差別很大，經(jīng)過(guò)接種培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)黃豆粉培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基較其它培養(yǎng)基更適合組織塊接種培養(yǎng)。培養(yǎng)到第10天可以看到在組織塊表面有菌絲生長(zhǎng)，菌絲較短白色；培養(yǎng)到第16天時(shí)可以明顯看出菌絲已經(jīng)生長(zhǎng)很濃密，而且長(zhǎng)勢(shì)很好。美味牛肝菌不同部位組織接種培養(yǎng)后菌絲生長(zhǎng)狀況見表1、圖2。

表1 美味牛肝菌子實(shí)體不同部位組織分離菌絲生長(zhǎng)狀況

圖2 不同培養(yǎng)基中美味牛肝菌組織分離菌絲生長(zhǎng)狀況（左為培養(yǎng)10 d，右為培養(yǎng)16 d）

圖3 菌絲在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況（左為培養(yǎng)6 d，右為培養(yǎng)18 d）

2.2菌絲轉(zhuǎn)接純化挑取組織中生長(zhǎng)健壯、顏色潔白的菌絲轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。從組織塊上轉(zhuǎn)接過(guò)來(lái)的菌絲培養(yǎng)三四天后開始長(zhǎng)出菌絲，菌絲生長(zhǎng)速度明顯加快。在不同培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況不同，在培養(yǎng)基②、⑤、⑥中菌絲緊緊貼附著培養(yǎng)基生長(zhǎng)，菌絲短不易挑取；在培養(yǎng)基⑦中菌絲向上生長(zhǎng)，菌絲也較長(zhǎng)較粗壯易挑取。在菌絲生長(zhǎng)后期會(huì)產(chǎn)生黃褐色的水珠狀分泌物，有分泌物產(chǎn)生的培養(yǎng)基即使后期變干了也不會(huì)被污染，說(shuō)明這種褐色分泌物對(duì)防止污染有一定作用，原因還有待進(jìn)一步研究。第一次轉(zhuǎn)接后美味牛肝菌在不同培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況見表2、圖3。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)②、⑤、⑥、⑦四種培養(yǎng)基均適合菌絲生長(zhǎng)，菌落在②培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，菌落面積最大，但是它的菌絲都附著在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，菌絲短而且不粗壯，從整體看⑦中的菌落雖然小但是菌絲明顯優(yōu)于其他的培養(yǎng)基，對(duì)菌絲生長(zhǎng)而言是最適合的培養(yǎng)基。

挑取經(jīng)第一次轉(zhuǎn)接后的菌絲進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)接，發(fā)現(xiàn)菌絲更容易存活生長(zhǎng)也更好，這可能是因?yàn)榈谝淮无D(zhuǎn)接時(shí)菌絲從子實(shí)體組織塊上取下來(lái)，還沒有適應(yīng)培養(yǎng)基，較難存活。而第二次轉(zhuǎn)接時(shí)由于經(jīng)過(guò)組織分離和第一次轉(zhuǎn)接的馴化，已經(jīng)能較好的適應(yīng)人工培養(yǎng)基。取菌絲產(chǎn)生的組織進(jìn)行培養(yǎng)也很容易存活，部分直接生長(zhǎng)成組織，部分在組織外部生長(zhǎng)出菌絲，菌絲與組織一起生長(zhǎng)。如圖4所示（左圖為第二次轉(zhuǎn)接菌絲生長(zhǎng)情況，右圖為生長(zhǎng)后期出現(xiàn)組織分化）。

表2 菌絲轉(zhuǎn)接在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況

圖4 第二次轉(zhuǎn)接菌絲在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況

圖5 菌絲生長(zhǎng)和組織分化（培養(yǎng)基⑦）

圖6 Y5樣品和Y1樣品比對(duì)結(jié)果

為了更好的觀察菌絲的生長(zhǎng)，利用培養(yǎng)基⑦在生長(zhǎng)面積較大的培養(yǎng)瓶或三角瓶進(jìn)行菌絲的培養(yǎng)。從菌絲生長(zhǎng)情況看，菌絲在生長(zhǎng)初期潔白、濃密、粗壯，但生長(zhǎng)后期同樣也出現(xiàn)了組織分化，說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)到一定程度開始分化（圖5），在菌絲的保存上還需深入研究。

2.3菌絲的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 對(duì)生長(zhǎng)良好的菌絲進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)作為擔(dān)子菌的擔(dān)子結(jié)構(gòu)、鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)不是很明顯。在對(duì)菌絲組織進(jìn)行研磨時(shí)，散發(fā)出了濃郁牛肝菌香味，可初步判斷該菌絲確為美味牛肝菌菌絲。

2.3.2 分子鑒定 對(duì)培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的美味牛肝菌菌絲進(jìn)行DNA的提?。ㄟx取了編號(hào)為Y1和Y5的兩個(gè)樣，其中Y5直接從子實(shí)體取樣，Y1是由Y5轉(zhuǎn)接培養(yǎng)得到的菌絲），進(jìn)行ITS（Internal Transcribed Spacer）鑒定，利用Basic Local Alignment Search Tool進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖6。

結(jié)果表明，Y1和Y5為同一個(gè)種，中文學(xué)名為美網(wǎng)柄牛柄菌，拉丁學(xué)名Boletus reticulatus Schaeff.中文別名（同物異名）Boletus edulis subsp.reticulatus（Schaeff）Konr，分類地位為傘菌目牛肝菌科牛肝菌屬網(wǎng)柄牛肝菌（美味牛肝菌）。系統(tǒng)樹構(gòu)建如圖7。

圖7 系統(tǒng)樹構(gòu)建

3 小結(jié)與討論

研究成功分離出美味牛肝菌菌絲，同時(shí)在培養(yǎng)基中后期生長(zhǎng)已有組織分化。經(jīng)ITS鑒定，結(jié)果為：中文學(xué)名為美網(wǎng)柄牛柄菌，拉丁學(xué)名Boletus reticu?latus Schaeff.中文別名（同物異名）Boletus edulis sub?sp.reticulatus（Schaeff.）Konr，分類地位為傘菌目牛肝菌科牛肝菌屬網(wǎng)柄牛肝菌（美味牛肝菌）。

從表1、表2可以看出，研究所用的幾種培養(yǎng)基中，加入了黃豆粉（⑦）、玉米粉（②）和馬鈴薯汁（⑥）的培養(yǎng)基相對(duì)而言更適合應(yīng)用于美味牛肝菌菌絲的分離和培養(yǎng)，這主要是利用了天然成分黃豆粉、玉米粉和馬鈴薯中豐富的礦物質(zhì)和維生素；三種培養(yǎng)基相比又以黃豆粉培養(yǎng)基⑦最適合菌絲生長(zhǎng)，菌絲向上生長(zhǎng)，菌絲粗壯，菌落邊緣整齊圓形；而②和⑥培養(yǎng)基中菌落大，但菌絲生長(zhǎng)地并不好，菌絲緊貼著培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，菌絲短不易挑取。在⑦和⑥培養(yǎng)基中雖然都加入了酵母膏，但菌絲在⑦中生長(zhǎng)要好于⑥。由此可見，在對(duì)美味牛肝菌菌絲分離培養(yǎng)中，黃豆粉和酵母膏對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有重要影響。在菌絲生長(zhǎng)后期有部分菌絲出現(xiàn)組織分化，取這些組織進(jìn)行接種培養(yǎng)很容易培養(yǎng)出菌絲，且不易受污染。

就目前對(duì)美味牛肝菌菌絲分離培養(yǎng)的研究雖然較多[8-11]，但成功率不高，同時(shí)人工馴化工作也十分艱難[12-13]的現(xiàn)狀，研究在菌絲培養(yǎng)過(guò)程出現(xiàn)組織分化同時(shí)組織培養(yǎng)更易生長(zhǎng)的現(xiàn)象，為下一步探討人工培養(yǎng)提供了思路和依據(jù)。