趙占強，周玉香，洪 濤

(1.寧夏中衛(wèi)山羊選育場,寧夏中衛(wèi) 755006；2.寧夏大學農學院,寧夏銀川 7550021； 3.中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)農業(yè)和科技委員會,寧夏中衛(wèi) 755000)

不同濃度海藻糖對牛冷凍精液品質的影響

趙占強1，周玉香2，洪 濤3

(1.寧夏中衛(wèi)山羊選育場,寧夏中衛(wèi) 755006；2.寧夏大學農學院,寧夏銀川 7550021； 3.中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)農業(yè)和科技委員會,寧夏中衛(wèi) 755000)

【目的】為提高牛冷凍精液的保存效果，【方法】本試驗在新采集的牛精液中添加其他物質的基礎上添加0mol/L，0.014 mol/L ，0.028mol/L，0.042 mol/L濃度的海藻糖，比較不同濃度海藻糖對低溫保存牛精液品質的影響。【結果】表明：在相同的保存時間下，海藻糖濃度為0.042 mol/L時，精子活力最高，精子畸形率最低，對牛冷凍精液保存效果最佳?！窘Y論】說明海藻糖濃度在0.042mol/L時，對牛精液冷凍保存?zhèn)ψ钚　?/p>

牛精液；海藻糖；低溫保存；精液品質

海藻糖是由兩個葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷鍵構成的非還原性糖，自身性質非常穩(wěn)定，具有獨特的生物學特性，對生物有抗脫水、抗冷凍保護作用和抗高滲保護作用，同時海藻糖還有防止淀粉老化、防止蛋白質變性、抑制脂類物質酸敗、抑制魚腥味的生成、矯正味道和矯正氣味、抑制大米的米糠臭、保鮮、穩(wěn)定超氧化物歧化酶和補充能源等功能特性[1]。

試驗在采集的牛精液中添加其他物質的基礎上,添加不同濃度的海藻糖作為冷凍保護劑，在相同存放條件下，相同存放時間內，對比找出精子活力高，精子畸形率低的最佳濃度的海藻糖，以提高精液解凍后的活力和保護效果，從而提高受精率。

1 材料和方法

1.1 牛精液的采集

本試驗所選取的種公牛是來自寧夏某肉牛場的種公牛，選擇年齡為2～3歲，健康無病，繁殖性能好的5頭西門塔爾種公牛，假陰道法采精，采精頻率每周2次。

1.2 試劑與耗材

主要試劑：果糖，Tris，海藻糖，檸檬酸，姬姆薩染色液、蒸餾水、青霉素、鏈霉素。

主要耗材：相差顯微鏡、電子天平、恒溫水浴箱、5.0 mL試管、試管架、載玻片、蓋玻片、血細胞計數器、移液槍、250 mL燒杯、100 mL量筒、玻璃棒、定性濾紙、消毒紙巾、硫酸紙、滅菌牛皮紙、5 mL注射器、在保持滲透壓不變的情況下配制不同濃度海藻糖：A組：0 mol/L為對照組，B組：0.014 mol/L，C組：0.028 mol/L，D組：0.042 mol/L。

2 具體試驗方法[1]

2.1 精液的采集

精液用假陰道采集。向假陰道內注入38℃左右的溫水，內胎前三分之二處用涂抹棒均勻涂擦適量消毒凡士林潤滑劑，并從活塞孔打氣，使假陰道有適度的壓力。將采精公牛包皮清洗干凈，采精前先讓公?？张酪淮?，采精員右手持假陰道，站在公牛右后方，當公牛起跳，前肢爬上臺牛時，迅速向前用左手托著公牛包皮，右手持假陰道與臺牛成40度角，假陰道口斜向下方，左右手配合將公牛陰莖自然地引入假陰道內，公牛往前一沖即完成射精動作，公牛隨即而下，采精員右手緊握假陰道，隨公牛陰莖而下，待公牛前肢落地時，緩慢地把假陰道脫出，立即將假陰道口斜向上方，打開活塞放氣，使精液盡快地流入集精管內，然后小心地取下集精管，迅速送至精液處理室。

2.2 精液的稀釋與保存

采集精液進行活力檢測，將等溫稀釋液與合格精液混合進行稀釋；按照試驗方案分組，并在試管上做標記，保存在集精杯(37℃)中靜置30 min，使精子與稀釋液充分接觸，然后放入4℃冰箱，用8層紗布覆蓋在集精杯口，每隔24 h觀察1次，并記錄結果。

2.3 精子的活力檢測

將低溫保存的稀釋精液搖勻后,取中層精液10 μL在37℃恒溫板上等溫預熱的載玻片上滴片,蓋上蓋玻片后置于配有37℃恒溫臺的顯微鏡下放大400倍檢查200個以上精子,分別統(tǒng)計呈直線運動的精子數占精子總數,計算精子活力?；盍υu定一般采用十級評分法，即按呈前進運動的精子所占百分率分別評為1.0、0.9、0.8……0等10個等級，若無前進運動的精子，則以“0”表示之。例如“0 .8”就表示呈前進運動的精子數占總精子數的80%?！?.0”則表示100%的精子呈前進運動。

2.4 精子畸形率的的檢測

將低溫保存好的精液取出解凍后，滴一滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片將樣品均勻地涂于載玻片上，每一樣品制作兩個抹片。自然晾干后，用中性福爾馬林固定15 min，水洗后吹干或晾干，用姬姆薩染色液染色1.5 h，清水漂洗后晾干。在顯微鏡(400～600倍)下，每個抹片觀察200個以上精子(分左、右二個區(qū))，按下面公式計算精子畸形率。

A=Al÷S×100

其中A：畸形率即頂體完整率，A1：畸形精子數；S：精子總數

2.5 數據統(tǒng)計分析

試驗數據用SAS8.2軟件包進行方差分析，試驗結果以±SD表示，并采用t檢驗檢驗其差異顯著性[2]。

3 結果與分析

由表1可知 ，在相同條件，相同保存時間下，隨著時間的延長，各組精子的活力都呈現下降趨勢，96 h前，A、B、C、D四組精子活力下降不明顯，差異不顯著(P>0.05)；144 h時，A、B、C、D四組精子活力下降明顯，A組精子活力下降最快，D組精子活力下降最慢，C組與A組差異顯著(P<0.05)。由表2可知，同一保存時間下，添加不同濃度的海藻糖，D組的精子畸形率最低，D組與A、B、C組精子畸形率比較差異顯著(P<0.05)，而A、B、C組間的精子畸形率差異不顯著(P>0.05)。

注：同列數字肩上有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 各組精液精子在相同保存時間下畸形率情況

注：同行數字肩上有相同字母表示差異不顯著，有不同字母表示差異顯著。

4 小結與討論

評定精子品質的指標較多，活力反映精子直線前進運動的能力，活力與精子的運動能力密切相關，在獲能、頂體反應和受精過程中，精子膜必須具有生化活性。若精子質膜受到損傷，則直接導致精子活力和受精能力下降[3]。本試驗采用測定精子活力和畸形率來研究牛精子的品質，從結果可以看出，在低溫保存條件下稀釋液中添加適當濃度海藻糖，隨著時間延長，可以有效的提高精子的活力，并降低精子的畸形率，與不添加海藻糖的對照組差異顯著。

4.1 海藻糖對低溫保存精液活力的影響

張樹山等研究發(fā)現在豬的冷凍稀釋液中添加海藻糖可提高凍后精子的活率、頂體完整率、膜功能的完整率等指標[4]。海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。本試驗中，添加不同濃度的海藻糖在24 h、48 h、72 h、96 h時差異不顯著(P>0.05)。在144h時差異顯著(P<0.05)。表明隨著保存時間的延長，海藻糖的特性就發(fā)揮的越好，特別是添加0.042 mol/L時精子的存活力差異就越顯著。

4.2 海藻糖對低溫保存精液畸形率的影響

Molinia[5]等研究表明，在稀釋液中沒有甘油存在的情況下，蔗糖或海藻糖的存在使綿羊精子解凍后的活率比葡萄糖存在時高，說明二糖具有冷凍保護作用。據報道綿羊精液中添加 0.2 mol/L 海藻糖經冷凍解凍后可顯著地降低畸形率[6]。試驗中的結果顯示，在精液中添加0.042 mol/L的海藻糖對精子畸形率的影響明顯的低于其他三組，并且差異顯著。表明冷凍精液稀釋液中添加0.042 mol/L的海藻糖可有效使精子的畸形率下降。

[1] 桑潤滋編.動物繁殖生物技術[M].中國農業(yè)出版社,2002.

[2] 貴州農學院主編.生物統(tǒng)計附試驗設計[M].北京：中國農業(yè)出版社，1999.

[3] 胡建宏,李青旺,江中良,海藻糖對豬精液冷凍保存效果的影響[J]畜牧獸醫(yī)學報,2006, 37(12):12-18.

[4] 張樹山，李青旺，李剛等.海藻糖、蔗糖和乳糖對豬精液冷凍保護效果的影響[J], 西北農林科技大學學報,2006,34(6):41-45.

[5] Molinia FC, Evans G, Casares PI, Maxwell WMC. Effect of monosaccharides and disaceliaridesin Tris-based diluents on motility ,acrosome integrity and fertility of pellet frozen ram spermatozoa[J]. Anim Reprod Sci, 1994,36:13-22.

[6] 徐振軍,車世德,趙冰等. 絨山羊精液低溫保存技術研究[J], 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2009,52(10):29-30.

Effect of Different Concentrations of Trehalose on Cattle Frozen Semen

ZHAO Zhan-qiang1, ZHOU Yu-xiang2, HONG Tao3

(1.Goatbreedingfarmofzhogwei,zhongwei,Gansu, 755006; 2.Agriculturalcollege,NingxiaUniversity,Yinchuan,Gansu, 7550021)

:【Objective】To improve the preservation results of cattle frozen semen 【Method】 The experiment added the trehalose of different concentration (0 mol/L, 0.014 mol/L, 0.028mol/L, 0.042 mol/L) into the new collected cattle semen with the basis of other additives in order to compare the effect of different concentrations of trehalose on cattle frozen semen 【Result】Under the same preservation time, when the concentration of trehalose was 0.042 mol/L, sperm motility was the highest and sperm abnormality rate was the lowest, and the preservation effect of cattle frozen semen was the best 【Conclusion】Our study illustrated that the harm for the preservation of cattle frozen semen could be minimized when the concentration of trehalose is 0.042mol/L.

cattle semen; trehalose; cryopreservation; semen quality

2016-11-17 接收日期:2016-12-05

趙占強(1985-)，男，漢，寧夏銀川人，本科，專業(yè)：動物醫(yī)學，從事工作：中衛(wèi)山羊的品種保護。

S823.2

A

1001-9111(2017)01-0023-03