梁瑞峰 李開言 王曉麗 張雪俠 王 軍

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004)

降壓寶藍片含藥血清對大鼠血管成纖維細胞增殖及表型轉化的影響

梁瑞峰 李開言 王曉麗 張雪俠 王 軍

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004)

目的 觀察降壓寶藍片含藥血清對大鼠血管緊張素Ⅱ誘導的成纖維細胞增殖及轉化的影響。方法 原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞，分為空白組、模型組、降壓寶藍片含藥血清低、中、高濃度組(體積分數(shù)為5%、10%、15%)。用噻唑藍(MTT)法測定細胞增殖活性，羥脯氨酸法檢測膠原含量，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測轉化生長因子(TGF)-β1含量，免疫組化法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達情況。結果 與模型組相比，降壓寶藍片含藥血清高濃度組細胞增殖、膠原、TGF-β1分泌、α-SMA表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)，中濃度組細胞增殖、TGF-β1含量顯著降低(P<0.05)。結論 降壓寶藍片含藥血清可抑制成纖維細胞增殖和表型轉化。

含藥血清；成纖維細胞；增殖；表型轉化

血管重構是高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的共同病理生理過程，對其研究以往主要集中于內膜內皮細胞和中膜平滑肌細胞，近年來研究表明，血管重構主要是基于外膜的病理過程〔1〕，血管損傷后血管成纖維細胞(AFs)向肌成纖維細胞(MFs)的轉化是這一過程的關鍵事件〔2〕。轉化生長因子(TGF)-β1是病理性血管重構過程中重要的因子，其能夠促進AFs過度增殖，誘導AFs向MFs轉化，上調α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及膠原的表達〔3〕。AFs的增殖及表型轉化在血管重構的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，抑制AFs增殖和表型轉化對改善病理性血管重構具有重要意義。降壓寶藍片主要用于肝火亢盛型高血壓的治療，臨床療效確切，動物試驗表明降壓寶藍片可以改善自發(fā)性高血壓大鼠的血管重構〔4〕。本實驗通過觀察降壓寶藍片含藥血清對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的AFS增殖及表型轉化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體重180～200 g，購自河南省實驗動物中心，合格證號SCXK(豫)2010-0002。

1.2 藥物與試劑 降壓寶藍片，河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室提供，批準文號：豫藥制字Z20121056，批號20130404；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；噻唑藍(MTT)購自Amresco公司；AngⅡ購自Sigma公司；羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物公司；TGF-β1試劑盒、α-SMA單克隆抗體、SABC試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 全功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)；2K15型冷凍離心機(Sigma公司)；倒置相差顯微鏡(重慶光學儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清制備 20只SD大鼠隨機分為空白組和降壓寶藍片組，每組10只。按體表面積法換算動物的等效劑量，降壓寶藍片組給予降壓寶藍片0.9 g·kg-1·d-1(等效劑量的5倍)，空白組給予相同體積的蒸餾水，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥后2 h，麻醉腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?〕。

1.4.2 細胞培養(yǎng) SD大鼠麻醉，取胸主動脈，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，眼科剪縱向剪開血管，血管內膜面朝上鋪于培養(yǎng)皿上，用眼科彎鑷輕輕刮去內膜，然后固定血管一端，用眼科彎鑷剝離中膜，余下外膜，PBS漂洗1次，將外膜置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，剪成1 mm2組織塊，平鋪于25 ml培養(yǎng)瓶底，翻轉使瓶底在上，貼壁培養(yǎng)4 h，添加含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 ml，小心翻轉培養(yǎng)瓶使組織塊浸于DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。5～7 d后待細胞達70%融合時胰酶消化傳代，第3～6代細胞用于試驗。

1.4.3 實驗分組 實驗設空白組(體積分數(shù)為15%的空白血清)、模型組(15%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)、降壓寶藍片低濃度組(5%降壓寶藍片血清+10%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)、中濃度組(10%降壓寶藍片含藥血清+5%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)及高濃度組(15%降壓寶藍片含藥血清+10-6mol/L AngⅡ)，每組均設6個復孔。

1.4.4 MTT法檢測細胞增殖活性 以1×105個/ml的AFs接種于96孔板中，另設6孔為陰性組(無細胞)，培養(yǎng)24 h后，分組處理20 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，避光震蕩10 min，用酶標儀于570 nm處測定各孔的吸光度(OD)。

1.4.5 測定細胞膠原含量 細胞以1×105個/ml接種于48孔板培養(yǎng)24 h后，吸取0.5 ml上清液，按羥脯氨酸測試盒說明進行操作，測定細胞內膠原含量。

1.4.6 ELISA檢測TGF-β1含量 細胞以1×105個/ml接種于接種于24孔板，藥物作用24 h后吸取0.5 ml上清液，采用ELISA法檢測細胞液中TGF-β1 含量。

1.4.7 免疫組化檢測α-SMA表達 將細胞爬片置于6孔板中，按照每孔1×104個的密度接種細胞，24 h后，每組加入相應藥物，培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3次， 3%過氧化氫滅活10 min，山羊血清封閉10 min，加α-SMA單抗(濃度1∶100)，4℃過夜，PBS沖洗，加生物素標記的二抗，室溫孵育60 min；PBS沖洗，過氧化物酶孵育60 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察，陽性細胞細胞質呈棕黃色，于鏡下隨機取6個非重疊視野，計算α-SMA陽性細胞百分率。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。

2 結 果

2.1 AFs的培養(yǎng)及形態(tài) 組織塊貼壁培養(yǎng)7 d后，開始有細胞從組織塊邊緣爬出(圖1a)，細胞形狀不規(guī)則，多呈梭形、多角形或不規(guī)則形狀。原代細胞經胰酶消化后回縮、變圓，傳代后生長較均勻，傳至3～8代后的細胞生長最為旺盛(圖1b)，5～7 d后可見細胞呈80%融合狀態(tài)。

圖1 AFs形態(tài)觀察

2.2 降壓寶藍片含藥血清對細胞活力的影響 空白組細胞活力(0.352±0.058)與模型組(0.504±0.060)相比顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，降壓寶藍片含藥血清中、高濃度組(0.463±0.068，0.392±0.073)細胞增殖顯著降低(P<0.05或P<0.01)，低濃度組(0.522±0.078)細胞增殖無明顯變化(P>0.05)。

2.3 降壓寶藍片含藥血清對各組細胞上清液中膠原、TGF-β1的影響 與空白組相比，模型組細胞培養(yǎng)上清液膠原、TGF-β1含量顯著升高；與模型組相比，降壓寶藍片含藥血清中濃度組(體積分數(shù)10%)上清液中TGF-β1含量降低(P<0.05)，降壓寶藍片含藥血清高濃度組(體積分數(shù)15%)上清液膠原、TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 降壓寶藍片含藥血清對上清液中膠原、TGF-β1含量的影響

與模型組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

2.4 免疫組化檢測AFs中α-SMA蛋白的表達 空白組細胞α-SMA陽性表達為陰性，模型組陽性細胞率(18.16%)明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，降壓寶藍片含藥血清低、中、高濃度組細胞陽性率(15.28%，14.02%，11.12%)顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 AFs中α-SMA蛋白的表達(DAB，×250)

3 討 論

血管主要由內膜的內皮細胞、中膜的平滑肌細胞、外膜的AFs以及細胞外基質組成。血管重構是高血壓、動脈粥樣硬化、血管內膜損傷后再狹窄等多種心血管疾病發(fā)病的共同病理基礎。傳統(tǒng)的觀點認為，處于血管最外層的血管外膜只對血管起支持和營養(yǎng)作用，近年研究表明，外膜的AFs在高血壓等刺激下表型轉化為MFs，其標志性蛋白是α-SMA〔6〕，細胞進而發(fā)生增殖、遷移、分泌大量細胞外基質，參與血管新生內膜的形成〔7〕。外膜AFs是血管重構的重要部位，并成為血管重構防治的新靶點〔8〕。正常的AFs缺少TGF-β1基因的表達，血管損傷后，細胞分泌TGF-β1增加，并刺激細胞增殖〔9〕。α-SMA 是MFs的標志蛋白，其表達的增加能反映靜止型組織細胞向活躍型MFs的轉化，通過這種轉化，細胞將獲得過表達細胞外基質的能力〔10,11〕。本實驗顯示，AngⅡ刺激后，AFs分泌的TGF-β1和膠原增加，細胞增殖明顯增強，α-SMA表達，而經過降壓寶藍片含藥血清干預，AFs的增殖能力下降，TGF-β1和膠原分泌減少，α-SMA表達受到抑制。

綜上所述，本研究提示降壓寶藍片含藥血清可能通過抑制AFs的增殖和表型轉化從而改善血管重構,在防治血管重構方面發(fā)揮積極作用，但具體的分子機制尚有待進一步研究。

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〔2015-12-10修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

國家中醫(yī)藥管理局重點學科建設項目(國中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕30號)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)心病學重點學科基礎研究課題(No.1304483)

王 軍(1961-)，男，博士，研究員，碩士生導師，主要從事中藥心血管藥理學研究。

梁瑞峰(1983-)，男，碩士，助理研究員，主要從事中藥藥理及中藥藥性研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)09-2103-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.009