符鋒　陳以勝　李曉紅

[摘要] 目的 模擬腦組織彈性模量制備相應二維培養(yǎng)基，比較亞低溫聯(lián)合溫敏臍帶間充質(zhì)干細胞（tsUC）與常溫下臍帶間充質(zhì)干細胞（UC）的分化特性。 方法 應用單、雙丙烯酰胺的聚合作用，制備彈性模量為0.5 kPa的聚丙烯酰胺（PA）水凝膠，用于模擬腦組織的生物力學環(huán)境，并測其彈性模量。從新生兒臍帶中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞，通過感染攜溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒來制備tsUC。實驗分為3組：UC+常溫+玻片組（A組）、UC+常溫+0.5 kPa組（B組）、tsUC+亞低溫+0.5 kPa組（C組）。動態(tài)觀察各組細胞的生長情況和形態(tài)變化，并于7 d后行細胞免疫熒光檢測各組細胞的分化水平并計算分化神經(jīng)元的軸突長度。 結果 PA水凝膠彈性模量的檢測結果為（0.50±0.03）kPa。B、C兩組部分細胞出現(xiàn)細長的胞突，并存在β-tubulin Ⅲ陽性細胞，A組細胞鏡下無明顯神經(jīng)元形態(tài)，也無β-tubulin Ⅲ陽性表達。B、C兩組的神經(jīng)元分化率以及熒光下軸突長度均明顯高于A組，但組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 在模擬腦組織彈性模量的環(huán)境中，tsUC具有向神經(jīng)元分化的能力，可應用于亞低溫治療下腦損傷修復的細胞移植研究。

[關鍵詞] 溫敏臍帶間充質(zhì)干細胞；聚丙烯酰胺水凝膠；彈性模量；生物力學

[中圖分類號] R651.15 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（c）-0014-04

[Abstract] Objective To manufacture two-dimensional culture medium of brain tissue elastic modulus， and to compare the differentiate property of temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells （tsUC） under mild hypothermia treatment （MHT） and umbilical cord mesenchymal stem cells （UC） under normal temperature （NT）. Methods Acrylamide and bis-acrylamide were applied to synthesise polyacrylamide hydrogel of 0.5 kPa in elasticity modulus. UC were isolated from umbilical cord of the newborn， and then the tsUC were obtained through the infection of temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen （ts-SV40LT） retrovirus. There were three experiment groups in this study， including UC+NT+glass （group A）， UC+NT+0.5 kPa PA （group B）， and tsUC+MHT+0.5 kPa PA （group C）. Cell growth and morphological changes in each group were given dynamic observation. 7 days later， cell immunofluorescence were implemented， with the differentiation level of each group estimated and the axon length of the differentiated neurons calculated by using Image J software. Results The elasticity modulus of PA gels was （0.50±0.03） kPa. A small amount of cells resembling the neurons were presented in group B and C， with small soma and long， slender protuberances. Cell immunofluorescence statistics demonstrated that the cells differentiated into neurons expressing beta-tubulin Ⅲ. The neuron differentiation rate and axon length were significantly higher than that of group A， which have no beta-tubulin Ⅲ expressing. However， there was no obvious difference between group B and C （P > 0.05）. Conclusion tsUC can differentiate to neurons in the environment mimicking the elastic modulus of brain tissue， which can be applied into cell transplantation of brain injury under MHT.

[Key words] Temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells； Polyacrylamide gels； Elastic modulus； Biomechanics

細胞生物學性能的調(diào)控機制與細胞的生物力學特性有關，包括細胞內(nèi)部的收縮力、細胞與基質(zhì)之間的牽張力、細胞與細胞之間的相互作用力等[1-2]。體外培養(yǎng)干細胞時，培養(yǎng)基質(zhì)的彈性模量是細胞生物力學的一個重要體現(xiàn)，且對干細胞分化具有調(diào)節(jié)作用[3-5]。人臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC）具有多向分化的潛能，在彈性模量為11～30 kPa的培養(yǎng)基中多向成骨細胞分化，在2.5～5.0 kPa的培養(yǎng)基中多向脂肪細胞分化，而在0.1～1.0 kPa的培養(yǎng)基中，則可能向神經(jīng)元進行分化[4，6]。

本課題組前期已經(jīng)建立了一種溫敏臍帶間充質(zhì)干細胞（temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells，tsUC）系，發(fā)現(xiàn)tsUC在亞低溫（mild hypothermia treatment，MHT）作用下可促進創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）大鼠神經(jīng)功能的恢復[7-8]，并對tsUC的增殖、溫度敏感等特性進行了初步探討[9]，但其生物力學特性尚不明確。本實驗擬在體外對人UC進行擴增以及力學誘導，觀察其在模擬腦組織硬度的培養(yǎng)基中的分化情況，從力學角度探討MHT聯(lián)合tsUC的分化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新生兒臍帶（由武警后勤學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，已通過武警后勤學院附屬醫(yī)院倫理協(xié)會審查），攜溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒（加利福尼亞大學，美國），神經(jīng)元β-tubulin Ⅲ一抗及熒光標記二抗（Millipore，美國），UC流式細胞檢測試劑盒（BD，美國），單丙烯酰胺（Amresco，美國），雙丙烯酰胺（天津光復精細化工研究所），硝化纖維、苯基疊氮化物交聯(lián)劑（sulfo-SANPAH）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷（天津鼎國生物技術有限責任公司），I型膠原蛋白（Sigma，美國）。

1.2 聚丙烯酰胺水凝膠的制備和檢測

將單、雙丙烯酰胺（0.03%～0.3%）按不同比例混合[10]，加入過硫酸銨（1/200 V）和TEMED（1/2000 V）置于凹槽中后蓋以玻璃板。凝結后切取2 cm×1 cm×2 mm的樣本，應用力學試驗機（Instron 5865，美國）進行拉伸測試，重復測量10次，篩選出彈性模量為0.5 kPa的PA水凝膠。

1.3 模擬腦組織彈性模量二維培養(yǎng)基的制備

根據(jù)上述檢測結果，配制彈性模量為0.5 kPa所對應的單丙烯酰胺和雙丙烯酰胺混合液[11]。22 mm × 22 mm蓋玻片表面均勻涂抹3-氨基丙基三甲氧基硅烷后浸泡在0.5%戊二醛溶液中，30 min后清洗、晾干，并在玻片表面涂硝化纖維以增加黏性。蓋玻片均勻鋪被25 μL混合液后加蓋經(jīng)二氯二甲基硅烷預處理的18 mm×18 mm蓋玻片。待聚合完成后，暴露水凝膠并紫外消毒。將200 μL sulfo-SANPAH（50 mmol/L，pH=8.5）均勻滴在水凝膠表面，于無菌罩中紫外光活化5 min。將0.2 mg/mL的I型膠原蛋白均勻鋪在水凝膠表面，0.2 mg/mL的I型膠原蛋白包被玻片作為對照組。

1.4 tsUC的建立與鑒定

從健康新生兒臍帶中分離出UC，進行體外培養(yǎng)、擴增，用流式細胞分析儀（BD，美國）測定各類抗原的陽性率[6]。細胞融合率60%時，用含4 μg/mL聚凝胺的tsSV40LT病毒懸液對細胞感染48 h，并根據(jù)前期研究方法對細胞進行鑒定[7-9]。將感染成功的tsUC置于33℃培養(yǎng)箱中，余培養(yǎng)條件同UC[12]。

1.5 實驗干預及分組

實驗按培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基彈性模量分為3組：UC+NT+glass組（A組）為玻片上常溫培養(yǎng)UC；UC+NT+0.5 kPa組（B組）為0.5 kPa的PA水凝膠上常溫培養(yǎng)UC；tsUC+MHT+0.5 kPa組（C組）為0.5 kPa的PA水凝膠上亞低溫培養(yǎng)tsUC。各組細胞（5×103個/mL）均加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期在相差顯微鏡（Optic BD200-PH，美國）下觀察細胞的生長情況和形態(tài)變化。

1.6 細胞免疫熒光

各組細胞培養(yǎng)7 d后進行免疫熒光染色以檢測細胞分化情況。加入羊抗大鼠β-tubulin Ⅲ一抗和熒光標記的二抗，細胞核DAPI染色，于倒置熒光顯微鏡（Leica DMI4000B，德國）下觀察。隨機取10個位點計數(shù)，并計算各組陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比，即為近似分化率。應用Image J軟件測量神經(jīng)元的軸突長度，計算各組神經(jīng)元軸突的平均長度[13]。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 tsUCMSCs培養(yǎng)和鑒定

流式細胞分析結果顯示，細胞表面標記CD90、CD105、CD73呈陽性表達，CD34、CD116、CD19、CD45、HLA-DR呈陰性表達。感染成功的tsUC呈漩渦狀生長，類似于UC，形態(tài)多為梭形、多邊形或成纖維細胞形態(tài)，大小均一（圖1）。

2.2 以PA水凝膠為基礎的細胞培養(yǎng)基

通過力學試驗機的測量及篩檢，最終得到彈性模量為（0.50±0.03）kPa的PA水凝膠。按相應比例于蓋玻片上配制出該彈性模量的培養(yǎng)基。見圖2。

2.3 光鏡下細胞形態(tài)變化

各組細胞均貼于玻片生長，其中A組細胞在7 d內(nèi)未發(fā)生明顯變化，B、C組細胞的胞體大致呈圓形或橢圓形，與A組的細胞相比，胞體逐漸變小，并出現(xiàn)長而纖細的胞突。見圖3。

2.4 細胞免疫熒光

B、C兩組均有β-tubulin Ⅲ表達陽性的細胞，提示分化的神經(jīng)元細胞；而A組無陽性表達。見圖4。B、C組神經(jīng)元總體分化率分別為11.3%和10.4%，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.5 軸突長度分析

B、C兩組細胞均有明顯突起，B和C組分化的神經(jīng)元軸突平均長度分別為（262.52±36.16）μm和（229.83±33.95）μm，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3 討論

細胞生物力學已逐漸成為醫(yī)學領域研究熱點。在各種內(nèi)外機械因素影響下，生物學信息可通過力學信號轉(zhuǎn)導作用于人體細胞，影響細胞的生長、增殖和分化[14]。干細胞原位移植后，其周圍不同彈性基質(zhì)可誘導其分化為更接近宿主組織的細胞[15-16]。Engler等[6]研究證實，在彈性模量為0.1～1.0 kPa的培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細胞可向神經(jīng)元分化。本研究以培養(yǎng)基彈性模量這一力學特性為基礎，探討了在模擬正常腦組織彈性模量的培養(yǎng)條件下tsUC向神經(jīng)元分化的水平。在培養(yǎng)基的制備方面，本研究借鑒了Engler等[6]和Pelham等[11]的方法，根據(jù)單、雙丙烯酰胺的不同混合比例，制備模擬腦組織硬度的PA水凝膠，并應用力學試驗機對其進行檢測，保證了培養(yǎng)基彈性模量的精確性，結合細胞培養(yǎng)液，制備二維培養(yǎng)基。

光鏡下可見，在彈性模量為0.5 kPa的培養(yǎng)基中，tsUC向神經(jīng)樣細胞變化，胞體變小、胞突伸長，可見典型的軸突，這與相同培養(yǎng)基中UC的細胞形態(tài)變化類似，而玻片上的UC無明顯形態(tài)變化。免疫熒光結果顯示，神經(jīng)元表達只在彈性模量為0.5 kPa的培養(yǎng)基中出現(xiàn)，且tsUC和UC之間無明顯差異。上述結果表明，與UC相比，tsUC在亞低溫條件下的分化能力基本不受影響，可向神經(jīng)元分化。由此說明在亞低溫的作用下，tsUC的生物力學性能并未發(fā)生明顯變化。

生物力學在神經(jīng)組織方面也有重要意義，正常腦組織的軟基質(zhì)能夠誘導間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化，因此模擬腦組織能保證移植干細胞的存活率和分化率。TBI后不僅腦組織的理化性質(zhì)受到破壞，而且腦細胞原本的力學微環(huán)境也發(fā)生相應改變，此時腦組織硬度明顯增大[19-20]，這便影響腦組織的原位細胞以及損傷處移植干細胞的生長和分化水平。本文以細胞生物力學為基礎，模擬腦組織彈性模量，證實了亞低溫作用下tsUC具有穩(wěn)定的生物力學性能和神經(jīng)元分化能力，從生物力學角度為亞低溫聯(lián)合tsUC移植治療TBI的研究提供了重要依據(jù)，并推動該項研究向臨床應用的轉(zhuǎn)化。

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（收稿日期：2016-09-10 本文編輯：程 銘）