胡松青 黃政 劉光，2 黃滟波 李琳 侯軼

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610； 3.華南理工大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640)

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)是位于真核細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種多功能酶，它主要由4個硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域按照a-b-b′-a′順序排列組成，并在C-末端含有一段由大量酸性氨基酸組成的c尾[1].結(jié)構(gòu)域a和a′含有催化活性位點CXXC基序(C為半胱氨酸，X為除半胱氨酸以外的氨基酸)，非催化結(jié)構(gòu)域b和b′雖不含活性位點，但存在與底物結(jié)合的疏水表面.正是這種結(jié)構(gòu)特性，使得PDI在催化新生肽鏈巰基/二硫鍵交換反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其能夠催化二硫鍵的氧化、還原以及異構(gòu)反應(yīng)[2].除了催化巰基/二硫鍵交換反應(yīng)，PDI還有另一個重要功能——分子伴侶，PDI的分子伴侶活性表現(xiàn)為促進新生或者變性蛋白質(zhì)的折疊以及恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然活性[3].

PDI每個結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浠钚载暙I不同，通過刪除或突變PDI結(jié)構(gòu)域可以考察PDI各結(jié)構(gòu)域和活性位點對其活性的影響[4].發(fā)揮巰基/二硫鍵交換反應(yīng)的最小單元為a或a′結(jié)構(gòu)域，其活性大小與突變?nèi)LPDI另一個結(jié)構(gòu)域活性位點的突變體活性相當[5].Klappa等[6]通過考察人來源PDI(hPDI)截短蛋白對多肽底物的結(jié)合作用發(fā)現(xiàn)，hPDI的所有結(jié)構(gòu)域都對底物結(jié)合發(fā)揮作用，且b′結(jié)構(gòu)域提供了最主要的結(jié)合位點.另外，Tian等[7]通過截除hPDI的c尾考察了截短蛋白對變性乳酸脫氫酶的分子伴侶活性大小，發(fā)現(xiàn)hPDI的c尾有助于穩(wěn)定PDI的分子伴侶活性.

目前，人和酵母來源PDI的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)得到了較為深入的研究[8- 9]，而有關(guān)植物來源PDI的性質(zhì)研究較為鮮見.相比于動物和微生物來源，植物來源PDI表現(xiàn)出不同的功能性質(zhì)，如大豆PDI包含非典型的氧化還原基序CXXC/S，其在體外不具有氧化還原活性和分子伴侶活性[10].因此，有關(guān)植物來源PDI的功能性質(zhì)研究有待深入.

筆者所在課題組前期利用大腸桿菌原核表達了具有生物活性的重組小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(wPDI)[11]，文中以wPDI為研究對象，通過表達wPDI各結(jié)構(gòu)域線性組合的截短蛋白，探究了其結(jié)構(gòu)域和活性位點氧化還原狀態(tài)對wPDI活性的貢獻，以期為深入理解wPDI的功能性質(zhì)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 宿主菌株與質(zhì)粒

克隆菌株E.coliDH5α、表達菌株E.coliBL21(DE3)購于寶生物工程有限公司；pET- 30b-wpdi重組表達質(zhì)粒由筆者所在實驗室自行構(gòu)建并保存.

1.1.2 宿主菌株與質(zhì)粒

主要試劑：胰島素、牛核糖核酸酶(RNase)、胞苷2′，3′-環(huán)單鈉磷酸鹽(2′，3′-cCMP)和三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，購自美國西格瑪試劑公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI和T4 DNA連接酶，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和DNA小提試劑盒，購自廣州英贊生物有限公司；還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等試劑均為分析純，購自健陽生物科技有限公司.

主要儀器：EDC- 80型基因擴增儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)；Infinite M200 Pro型酶標儀，瑞士TECAN公司生產(chǎn)；蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；NanoVue plus型微量紫外分光光度計、VCX500型超聲破碎儀，美國SONICS公司生產(chǎn).

1.2 分析及測試方法

1.2.1 wPDI截短蛋白的構(gòu)建分析

從小麥中克隆得到的wpdi基因(genbank No.AF262979.1)全長1 548 bp，與“Wyuna”品種小麥PDI基因同源性達99%.wpdi基因編碼515個氨基酸，去除信號肽序列后剩余490個氨基酸，按照Johnson等[12]的報道，各結(jié)構(gòu)域的界限分別為：a結(jié)構(gòu)域包含17-120位氨基酸，b結(jié)構(gòu)域包含128-221位氨基酸，b′結(jié)構(gòu)域包含244-338位氨基酸，a′結(jié)構(gòu)域包含358-459位氨基酸.按照結(jié)構(gòu)域界限對wPDI進行線性組合排列，設(shè)計出8個截短蛋白片段，分別為ABB′A′、BB′A′C、ABB′、B′A′C、AB、BB′、A′和A.

1.2.2 wPDI各截短蛋白的引物設(shè)計

不同wPDI截短蛋白的PCR擴增引物是以wpdi基因序列為模板，利用Primer Piemier 3.0設(shè)計的，具體信息見表1.

1.2.3 wPDI重組表達載體的構(gòu)建

以pET- 30b-wpdi質(zhì)粒為模板，分別加入wPDI各截短片段上、下游引物，進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min后，按以下的參數(shù)進行35次循環(huán)——98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s.最后，72 ℃延伸5 min后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并用DNA凝膠回收試劑盒回收各片段基因.

對基因回收產(chǎn)物和表達載體pET- 30b(+)分別進行BamHI和XhoI雙限制性內(nèi)切酶處理，酶切反應(yīng)條件為37 ℃、30 min.反應(yīng)產(chǎn)物回收、連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，并涂布在LB固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).菌落長成后，隨機挑選單克隆菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)條件同上.將經(jīng)雙酶切和電泳驗證結(jié)果為陽性的重組表達質(zhì)粒送樣測序，測序結(jié)果與已知的wpdi基因序列對應(yīng)結(jié)構(gòu)域部分進行比對，確認重組質(zhì)粒序列信息.

表1 不同wPDI截短蛋白的引物設(shè)計1)

1.2.4 表達與純化

將測序正確的各重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，并涂布在含Kan的LB固體平板培養(yǎng)基上.37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取形態(tài)飽滿的單克隆菌接種到含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)8～10 h后，將菌液以1∶100(體積比)的比例轉(zhuǎn)接到新的LB液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)2～3 h至菌液600 nm吸光值達到0.5～0.6后，加入IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達.ABB′A′、ABB′、BB′A′C、B′A′C和AB等截短蛋白添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，BB′、A 和 A′截短蛋白添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo).各截短蛋白的誘導(dǎo)表達條件均為20 ℃、200 r/min下誘導(dǎo)過夜.利用SDS-PAGE檢測重組蛋白質(zhì)的表達.

使用Ni-NTA金屬螯合層析和分子排阻層析組合層析方法對wPDI各截短蛋白進行分離純化.純化后的蛋白保存于含0.15 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)中，不含有對蛋白結(jié)構(gòu)和活性有影響的SDS和巰基還原劑.各截短蛋白的蛋白質(zhì)濃度采用微量紫外分光光度計測定，不同截短蛋白的消光系數(shù)ε(mL·mg-1·cm-1)值分別為0.805(ABB′A′)、0.745(ABB′)、0.661(BB′A′C)、0.787(B′A′C)、0.576(AB)、0.606(BB′)、0.817(A′)和0.790(A)，計算方法參考Simonian等[13]的報道.

1.2.5 活性測定

wPDI包含多種酶學(xué)活性，包括二硫鍵氧化酶、還原酶以及異構(gòu)酶活性[11].此外，wPDI還具有分子伴侶功能.不同活性的測定方法和底物制備方法參考曹佩等[14]的報道.

二硫鍵氧化酶和異構(gòu)酶的活性定義如下：單位時間內(nèi)生成1 μmol 3′-CMP所需酶量為一個酶活力單位，文中選取反應(yīng)時間10 min和20 min內(nèi)的線性區(qū)域分別計算各截短蛋白質(zhì)的二硫鍵氧化酶和異構(gòu)酶活性.通過計算開始沉淀時(吸光值相對提高0.01個單位)的延遲時間來分析不同截短蛋白質(zhì)二硫鍵還原活性的大小.分子伴侶活性的定義如下：30 min內(nèi)抑制吸光值增加0.01個單位所需酶量為一個酶活力單位.

1.2.6 蛋白質(zhì)電泳

使用還原型十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測截短蛋白質(zhì)的純度，使用非還原型SDS-PAGE檢測截短蛋白A和A′活性中心的氧化還原狀態(tài).還原型和非還原型SDS-PAGE方法參照文獻[15]中的方法.

2 結(jié)果與討論

2.1 wPDI截短蛋白的表達

按照wPDI的各結(jié)構(gòu)域界限，對其按線性排列方式進行分段組合，設(shè)計出8個截短片段，各片段的結(jié)構(gòu)域組成以及氨基酸個數(shù)如圖1所示.

圖1 wPDI各截短蛋白的結(jié)構(gòu)域信息

Fig.1 Structure domain information of truncated proteins of wPDI

利用亞克隆方法構(gòu)建不同截短蛋白重組表達載體.將構(gòu)建好的各重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達后利用SDS-PAGE進行表達分析，結(jié)果如圖2(a)所示.由圖可見：截短蛋白ABB′A′、BB′A′C、ABB′、B′A′C、BB′以及A′在電泳膠上的條帶十分明顯，說明它們具有可觀的表達水平；而截短蛋白AB以及A在電泳膠上的條帶較淡，說明它們雖有表達，但表達量相對于其他截短蛋白低.

2.2 wPDI截短蛋白的純化

各截短蛋白的N-端都帶有6×His融合標簽，利用Ni-NTA金屬螯合親和層析以及分子排阻層析組合層析方法對各截短蛋白進行純化，純化后利用還原型SDS-PAGE檢測各蛋白質(zhì)純度，結(jié)果如圖2(b)所示.由圖可見，wPDI的各截短蛋白在電泳膠上主要以單一條帶存在，它們在凝膠上的相對分子質(zhì)量都略大于其理論相對分子質(zhì)量(含標簽)，造成各截短蛋白質(zhì)在凝膠上遷移率變慢的原因可能與重組蛋白所帶His標簽上堿性氨基酸過多有關(guān)[16].另外，盡管各截短蛋白質(zhì)在電泳圖譜上表現(xiàn)為單體蛋白，但由分子排阻分析可得，截短蛋白A、A′和B′A′C應(yīng)處于聚集態(tài)形式，其他截短蛋白為單體形式，蛋白的聚集對其活性可能產(chǎn)生影響.

圖2 wPDI各截短蛋白的表達檢測和純度分析

2.3 wPDI截短蛋白的活性測定

wPDI包含二硫鍵的氧化還原活性、異構(gòu)活性以及分子伴侶活性.因BB′不含催化位點，故僅對其分子伴侶活性進行測定，而對剩下的截短蛋白進行酶學(xué)活性和分子伴侶活性的考察，結(jié)果如圖3所示.

2.3.1 二硫鍵還原酶活性

圖3(a)為不同截短蛋白二硫鍵還原酶活性測定結(jié)果.由圖可見，在所選蛋白質(zhì)中，除B′A′C、A′和A外，在文中實驗條件下，其他截短蛋白都表現(xiàn)出了二硫鍵還原酶活性，其中wPDI表現(xiàn)出了最強的二硫鍵還原酶活性，說明wPDI所有結(jié)構(gòu)域以及c尾都對其還原胰島素具有相應(yīng)的貢獻，該結(jié)果與Sun等[17]報道的結(jié)果一致.

圖3 wPDI各截短蛋白的酶學(xué)活性和分子伴侶活性測定結(jié)果

Fig.3 Results of enzymatic activities and molecular chaperone activity assay of different truncated proteins of wPDI

根據(jù)圖3(a)，以wPDI組與對照組開始沉淀時的時間差值為標準，分別計算各截短蛋白二硫鍵還原酶活性的相對大小，結(jié)果如表2所示.由表可見，僅含有a結(jié)構(gòu)域的截短蛋白的還原活性較不含a結(jié)構(gòu)域的小，如ABB′和AB的二硫鍵還原酶活性分別為全長wPDI二硫鍵還原酶活性的8.6%和15.1%，BB′A′C的活性則為67.8%.該結(jié)果表明wPDI的a′結(jié)構(gòu)域活性位點可能偏向還原態(tài)形式，而a結(jié)構(gòu)域偏向氧化態(tài)形式，與hPDI催化活性位點的氧化還原狀態(tài)類似[18].

表2 wPDI各截短蛋白的酶學(xué)活性和分子伴侶活性比較1)

進一步分析截短蛋白A的電泳結(jié)果(見圖4)可得，未經(jīng)DTT(二硫蘇糖醇)處理的截短蛋白A單體在電泳圖上位置只有一條條帶(黑色框標示).添加1 mmol/L DTT后，該單體條帶出現(xiàn)了上下兩條強度相當并緊挨著的條帶.繼續(xù)增大DTT濃度至2 mmol/L后，電泳圖上截短蛋白A單體靠上的條帶強度變?nèi)?，靠下的條帶強度則增強.而當DTT濃度增至4 mmol/L時，靠上的條帶基本消失，截短蛋白A單體條帶主要以靠下的條帶為主.這些結(jié)果表明，未加DTT處理的截短蛋白A單體以氧化態(tài)形式存在，添加少量DTT(<2 mmol/L)后，截短蛋白A單體以氧化態(tài)(上條帶)和還原態(tài)(下條帶)共存.而當DTT濃度進一步增大后，截短蛋白A單體由氧化態(tài)完全轉(zhuǎn)變成還原態(tài).該結(jié)果與活性測定的結(jié)果一致，直接證明了wPDI的a結(jié)構(gòu)域活性位點主要以氧化態(tài)形式存在.

圖4 DTT處理下截短蛋白A和A′的非還原SDS-PAGE分析

此外，分析截短蛋白A′的電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加DTT處理后，截短蛋白A′單體條帶并沒有發(fā)生與截短蛋白A單體條帶相類似的條帶遷移率變化(白色框標示)，這也從側(cè)面證明了wPDI的a′結(jié)構(gòu)域活性位點主要以還原態(tài)形式存在，與活性測定分析的結(jié)果相一致.

2.3.2 二硫鍵氧化酶活性

圖3(b)為不同截短蛋白二硫鍵氧化酶活性測定結(jié)果.由圖可見，所有截短蛋白都表現(xiàn)出了二硫鍵氧化酶活性，在30 min內(nèi)，wPDI引起的溶液吸光值變化最快，說明其二硫鍵氧化酶活性最高，但隨時間的延長，受到底物消耗以及產(chǎn)物抑制作用的影響，wPDI的氧化活性減弱，當時間達到60 min時，ABB′A′和AB實驗組引起的溶液吸光值變化量與wPDI組的相近，說明60 min后三者對變性rRNase的復(fù)性效率相近.以圖3(b)數(shù)據(jù)計算各截短蛋白的二硫鍵氧化酶活性相對大小，結(jié)果見表2.由表可見，所有截短蛋白的二硫鍵氧化酶活性都低于全長wPDI，同樣說明wPDI的各個結(jié)構(gòu)域?qū)ζ溲趸钚跃哂幸欢ㄘ暙I[4].

此外，僅含a結(jié)構(gòu)域的截短蛋白AB和ABB′的氧化活性要高于僅含a′結(jié)構(gòu)域的截短蛋白BB′A′C和B′A′C，進一步說明wPDI的a結(jié)構(gòu)域活性位點主要以氧化態(tài)為主，而a′結(jié)構(gòu)域活性位點主要以還原態(tài)為主.另外，截短蛋白A′活性位點主要以還原態(tài)為主，故二硫鍵氧化活性低；而A的活性位點雖然以氧化態(tài)為主，但因活性位點半胱氨酸參與形成分子間二硫鍵交聯(lián)，導(dǎo)致其氧化活性偏低.

2.3.3 二硫鍵異構(gòu)酶活性

圖3(c)為不同截短蛋白二硫鍵異構(gòu)酶活性測定結(jié)果.由圖可見，除截短蛋白A和A′外，剩余截短蛋白都表現(xiàn)出了一定的異構(gòu)活性.研究表明，發(fā)揮PDI異構(gòu)活性的最小結(jié)構(gòu)單元為ab或b′a′c，b′a′c的異構(gòu)活性與全長PDI突變a結(jié)構(gòu)域活性位點后的突變體異構(gòu)活性相當[19].比較不同截短蛋白的二硫鍵異構(gòu)酶活性發(fā)現(xiàn)，截短蛋白ABB′A′的異構(gòu)活性略高于wPDI，說明c尾并不是異構(gòu)活性所必需的(如表2所示).此外，截短蛋白所含結(jié)構(gòu)域單元越多，其異構(gòu)活性也相應(yīng)越大，同樣表明wPDI各結(jié)構(gòu)域?qū)ζ洚悩?gòu)活性都具有貢獻，這與Darby等[4]的研究結(jié)果相符.

PDI的異構(gòu)作用包括兩種機制[20]：一種是底物分子內(nèi)直接異構(gòu)機制，該機制不需要氧化還原劑的參與，僅要求PDI一個活性位點處于還原狀態(tài)即可；另一種是還原/氧化循環(huán)機制，需要兩個活性位點和氧化還原當量的同時參與.BB′A′C、B′A′C、ABB′和AB只含有一個催化結(jié)構(gòu)域，因此它們發(fā)揮異構(gòu)活性的機制應(yīng)為第一種機制；wPDI和ABB′A′含兩個催化結(jié)構(gòu)域，因此它們發(fā)揮異構(gòu)作用應(yīng)同時包含兩種機制，這應(yīng)該是它們的異構(gòu)活性較其他截短片段大的部分原因.

2.3.4 分子伴侶活性

圖3(d)為不同截短蛋白分子伴侶活性測定結(jié)果.由圖可見，除截短蛋白A、A′和BB′沒有表現(xiàn)出分子伴侶活性外，剩余截短蛋白都具有一定的抑制變性GAPDH凝沉的能力.研究表明，PDI的b和b′結(jié)構(gòu)域含疏水區(qū)域，提供了與底物結(jié)合的關(guān)鍵位點，該結(jié)合位點顯著影響其異構(gòu)活性和分子伴侶活性.Horibe等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，hPDI相關(guān)蛋白的a和a′結(jié)構(gòu)域單獨存在時不具有分子伴侶活性，這與文中所得結(jié)果相似.比較能夠發(fā)揮分子伴侶活性的截短蛋白發(fā)現(xiàn)，各截短蛋白至少需含有一個催化結(jié)構(gòu)域a(或a′)和非催化結(jié)構(gòu)域b(或b′)，表明wPDI發(fā)揮分子伴侶活性的最小結(jié)構(gòu)單元為ab或b′a′c[21].

表2示出了各截短蛋白對變性GAPDH的相對分子伴侶活性大小.由表可得，截短蛋白所含結(jié)構(gòu)域越多其分子伴侶活性越大，表明每個結(jié)構(gòu)域都有助于PDI結(jié)合底物，這與前人所獲得的研究結(jié)果相符[22].此外，比較wPDI和ABB′A′相對伴侶的活性大小發(fā)現(xiàn)，wPDI的c尾截去后損失了25%的全長wPDI分子伴侶活性.Tian等[7]通過比較hPDI和abb′a′(hPDI C-末端29個氨基酸被截除片段)對變性乳酸脫氫酶的分子伴侶活性大小，發(fā)現(xiàn)PDI的C-末端有助于穩(wěn)定PDI的分子伴侶活性.但若hPDI C-末端氨基酸截除數(shù)增至51個后，hPDI截短蛋白則喪失了恢復(fù)變性GAPDH活性的能力[23- 26].結(jié)合這些研究結(jié)果分析得到，hPDI的C-末端51個氨基酸中，靠近N端的22個氨基酸包含了對分子伴侶活性至關(guān)重要的氨基酸或結(jié)合位點，因此，wPDI截短蛋白ABB′A′伴侶活性降低的原因應(yīng)與C-末端截取的氨基酸有關(guān)，截除的41個氨基酸應(yīng)含與分子伴侶活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點.

以上結(jié)果表明，wPDI的a結(jié)構(gòu)域活性位點主要以氧化態(tài)形式存在，a′結(jié)構(gòu)域活性位點主要以還原態(tài)形式存在，wPDI的所有結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涿笇W(xué)活性和分子伴侶活性都具有一定的貢獻，c尾對其異構(gòu)活性沒有影響，但存在影響分子伴侶活性的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點.

3 結(jié)語

文中成功制備了8個wPDI截短蛋白片段，活性試驗表明，wPDI所有結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涠蜴I氧化、還原、異構(gòu)以及分子伴侶活性都具有貢獻，其中，a結(jié)構(gòu)域活性位點主要以氧化態(tài)形式存在，a′結(jié)構(gòu)域活性位點主要以還原態(tài)形式存在，c尾的缺乏不影響其異構(gòu)活性，但該部分含有影響分子伴侶活性的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點.研究結(jié)果不僅有助于理解wPDI活性與其結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系，而且為充分認識不同來源PDI的共性和特性問題起到了促進作用.

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