金魚草花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達特性分析

燕一波　郭玉雙

摘 要 以白蘇子（Perilla frutescens）花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因為探針，通過電子克隆和RT-PCR的方法從金魚草（Antirrhinum majus L.）葉片中克隆到花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因（AmGT1）的全長cDNA，并對其表達特性進行分析。結(jié)果表明：AmGT1全長892 bp，編碼277個氨基酸；進化分析表明AmGT1的氨基酸序列與白蘇子的同源性最高為79%，與其他花青素糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的同源性在42%～62%之間，表明AmGT1是從金魚草中克隆的新的花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因。實時定量RT-PCR分析表明：該基因在金魚草葉片中的表達量最高，根中的表達量最低；該基因雖然在紅色、粉色、黃色、白色花朵中均有表達，但在紅色花朵中的表達量最高，且存在一個從緊蕾期到松蕾期的躍變。

關(guān)鍵詞 金魚草；花青素；糖基轉(zhuǎn)移酶基因；表達分析

中圖分類號 Q342.3 文獻標識碼 A

Abstract The full-length cDNA of the anthocyanin glycosyltransferase gene（AmGT1）in snapdragon（Antirrhinum majus L.）was isolated through in silico cloning and RT-PCR confirmation based the anthocyanin glycosyltransferase gene of the common perilla（Perilla frutescens）as the probe. The sequence and expression characteristics were further analysed. The full-length of AmGT1 was 892 bp， encoding 277 amino acids. Phylogenetic analysis showed that the sequence identity between AmGT1 and Perilla frutescens was 79%， displaying the highest consistency and sequence identity with other found GT proteins was between 42%-62%. These results indicated that AmGT1 was a new-found plant glycosyltransferase gene. Quantitative RT-PCR analysis revealed that the expression level of AmGT1 was the highest in the leaf and lowest in the root； AmGT1 was expressed in red， pink， yellow and white flowers； but the expression level of red flowers was the highest and there was a jump from tight bud stage to loose bud stage.

Key words Snapdragon； anthocyanin； glycosyltransferase gene； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.019

花青素是類黃酮代謝途徑的分支產(chǎn)物，可以影響植物組織表面的溫度、氣味、顏色、濕度、質(zhì)感、光學特性等一系列生物學特征，并具有保健價值?；ㄇ嗨禺a(chǎn)生的這種生物獨特性是修飾基團、PH值、金屬離子等多種因素共同決定的。糖基化、甲基化、酰基化修飾是花青素常見的修飾基團[1]。在花青素糖基化修飾研究中，類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）和類黃酮5-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（5GT）是被發(fā)現(xiàn)的2種常見糖基轉(zhuǎn)移酶[2]。3GT和5GT均屬于UDPGT型糖基轉(zhuǎn)移酶超家族（GTs）的成員[3]，由MYB基因編碼[4]，Bronze1（bz1）和Bronze2（bz2）基因調(diào)控[5]，是花青素合成過程中的最后一個關(guān)鍵酶[6]。糖基轉(zhuǎn)移酶作用于花青素合成的后期，通過修飾基團的類別、穩(wěn)定性和位置對花青素的呈色、穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。有研究報道，矮牽牛dusky基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶插入突變引起花瓣顏色變化[7]，這說明糖基轉(zhuǎn)移酶與花色基因工程、顯色機理相關(guān)。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶可做為在花青素分子水平上的呈色機制、花色修改[8]研究和實現(xiàn)花色基因工程[9]的一個切入點。

金魚草（Antirrhinum majus L.）因花型獨特、花色艷麗豐富，用于切花、花槽、花壇、花池、花境等，是重要的觀賞植物；也是分子生物學研究的模式植物之一，以金魚草作為研究對象，研究花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因的序列組成和表達特性，可了解花青素糖基轉(zhuǎn)移酶體外酶促反應，有助于闡明金魚草糖基轉(zhuǎn)移酶的生物學功能，為研究花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程提供理論依據(jù)。目前對金魚草花青素生物合成方面的研究主要集中在相關(guān)基因（如delila、roseal）的分離克隆、蛋白質(zhì)純化、轉(zhuǎn)座子標簽等。本研究通過電子克隆和RT-PCR的方法從金魚草（Antirrhinum majus L.）葉片中克隆到金魚草花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因（AmGT1）的全長cDNA，并對其表達特性進行了分析，為進一步基因功能研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試金魚草塔希提（Antirrhinum ‘Tahiti）品系由貴州省煙草科學研究院分子遺傳重點實驗室提供?？寺≥d體pGEM T vector購自Promega公司，SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、Trizol Reagent均為Invitrogen公司產(chǎn)品。引物合成及DNA測序委托上海杰瑞公司完成。

1.2 方法

1.2.1 金魚草AmGT1基因的電子克隆 以已報道的白蘇子（Perilla frutescens）花青素糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA序列（GenBank登錄號：AB002818.1）為查詢探針，對GenBank中EST_others數(shù)據(jù)庫指定物種金魚草（Antirrhinu mmajus）進行BLAST檢索。利用DNAMAN6.0軟件將檢索到金魚草的全部EST序列拼接，形成重疊群（contig）。然后用此重疊群再次進行同源檢索拼接，重復以上步驟直至沒有更多金魚草的重疊EST檢索出，最終獲得金魚草的花青素糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA序列片段。

1.2.2 金魚草AmGT1基因引物序列設(shè)計 依據(jù)電子克隆的結(jié)果設(shè)計全長基因克隆引物（表1），引物序列如下：

1.2.3 金魚草RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 使用TrizolReagent提取金魚草葉片總RNA，操作參考說明書進行。

cDNA第一鏈的合成以總RNA樣品1 μg為模板，采用OligodT-AdaptorPrimer進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物即為總cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書略加修改進行。反轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃ 40 min，50 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

1.2.4 金魚草AmGT1基因的擴增 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系及程序如表2。

擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測?；厥漳康臈l帶并與T-Vector連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中，篩選陽性克隆并送交測序。

1.2.5 金魚草AmGT1基因的序列分析 利用在線的ORF finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）預測目的基因的開放閱讀框并翻譯成蛋白質(zhì)，運用DNAMAN 6.0、ClustalX 2.0和MEGA 4.1軟件進行蛋白質(zhì)的親水性預測、氨基酸序列比對和進化樹分析。

1.3 實時熒光定量RT-PCR檢測AmGT1基因表達水平

1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 以紅、粉、黃、白4種顏色的金魚草（Antirrhinum ‘Tahiti）花朵為材料，分別取緊蕾期（Ⅰ花冠先端著色，未伸出花萼）、松蕾期（Ⅱ花冠伸出花萼、閉合）、初開期（Ⅲ花冠筒上唇開裂、下唇抱合）和盛開期（Ⅳ上唇直立，下唇展開）的花瓣進行總RNA提取，分析AmGT1基因在不同顏色花朵中的表達情況。以紅花品種的根、莖和葉為材料分別提取總RNA，分析AmGT1基因在不同組織部位的表達特征。本試驗所用RNA均經(jīng)DNaseⅠ處理，除去DNA污染。利用Promega公司的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

根據(jù)目的基因序列和實時定量RT-PCR引物的設(shè)計原則設(shè)計引物。引物5′GCACCCTTACTCAC

CCTA3′/5′ACCTCTGTTCTCAGCCATA3′用來擴增目標基因，引物：5′TGGCATACATTGCTCTTG3′/5′TCATTGATGGCTGGAAAA3′用來擴增內(nèi)參基因AmActin（HQ853640.1）。

1.3.2 金魚草 AmGT1表達水平檢測 實時定量RT-PCR用ABI公司的ViAA 7系統(tǒng)進行，每個試驗3次重復，采用ΔΔCt法計算基因的相對表達量。測定根、莖、葉片表達量時，以紅花金魚草根AmGT1基因Ct值為對照組。測定不同花色中表達量時，以紅花金魚草花朵緊蕾期AmGT1基因Ct值為對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 金魚草AmGT1全長基因的克隆

通過電子克隆和RT-PCR擴增，獲得1條全長cDNA（圖1）。序列分析表明，該基因全長892 bp，包含36 bp的5′UTR（Untranslated region），834 bp的ORF（Open reading frame）以及22 bp的3′UTR，編碼一個277個氨基酸的蛋白質(zhì)。這是金魚草中克隆得到的第一個花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因，將其命名為AmGT1，GenBank基因登錄號KY417139。

2.2 金魚草AmGT1全長序列及同源序列的進化分析

利用Conserved Domain Database（CDD）軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）對AmGT1所編碼的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因具有一個保守的GRX家族的結(jié)構(gòu)域，屬于GTB亞家族（圖2）。該結(jié)果進一步證明了所克隆的基因為金魚草的花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因。

為了進一步分析AmGT1基因與其他物種花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因的關(guān)系，用MEGA4.0軟件將AmGT1基因與已報導的其他植物的花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。AmGT1的氨基酸序列與白蘇子的同源性最高，為79%，與其他已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GT蛋白的同源性在42%～62%之間，系統(tǒng)進化分析表明，AmGT1與白蘇子及橘色溝酸漿的花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因處于同一進化分支上（圖3），表明三者在進化上更為保守。

2.3 金魚草AmGT1在不同器官的表達水平檢測

利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析AmGT1基因的根、莖、葉組織的表達特性，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，AmGT1基因在金魚草的根、莖、葉中均有表達，且在葉片中的表達量最高，而在根中的表達量最低，表明該基因的表達沒有明顯的組織特異性。

2.4 金魚草AmGT1在不同花色中的表達水平檢測

利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析AmGT1基因在紅、粉、黃、白4種花色金魚草中的表達，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，AmGT1基因在金魚草的紅、粉、黃、白4種花色中均有表達，但表達量差異較大。AmGT1在紅花金魚草緊蕾期表達量較低，在松蕾期時躍變，迅速達到較高水平，之后一直保持較高水平。粉花金魚草AmGT1表達變化趨勢與紅花金魚草類似，但表達量遠小于紅花金魚草。黃花金魚草AmGT1松蕾期表達量比緊蕾期明顯增加，但初開時表達量降低，盛開時再次升高。白花金魚草AmGT1表達量一直處于較低水平，并呈逐漸降低趨勢。

3 討論

筆者以金魚草為材料，依據(jù)近緣植物白蘇子花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因為探針，利用電子克隆的方法，通過GenBank完整EST數(shù)據(jù)庫比對，獲得了AmGT1基因全長序列。同時，利用RT-PCR確認AmGT1在金魚草組織中表達，證明其與金魚草花色苷合成相關(guān)?；ㄇ嗨厥怯绊懟ㄉ闹饕紊x產(chǎn)物，被糖基化后以花色苷的形式存在并被保存在液泡中，不僅起到維持細胞代謝平衡的作用，在生命體急需時還可迅速調(diào)動。AmGT1基因的發(fā)現(xiàn)為未來深入研究金魚草花色苷分子合成及調(diào)控機理，了解AmGT1酶活性，利用AmGT1基因改變植物的花色、培育金魚草新品種提供依據(jù)。

一般認為花青素富含在花卉和彩色植物組織中。蘋果、草莓和荔枝等呈紅紫色植物組織中花色苷聚集，花青素糖基轉(zhuǎn)移酶活性也較強[10]。王應麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)箭葉淫羊藿GTs僅在紅色品種的葉片中表達，而在綠色品種葉片中不表達或表達量很低，并指出GTs表達同花青素的積累呈正相關(guān)性。張洪偉等[12]通過研究不同皮色洋蔥鱗莖、趙志常等[13]對不同顏色品種的芒果、李翔等[14]對紫長茄與圓白茄、肖繼坪等[15]對彩色馬鈴薯等研究都得出了相似的結(jié)論?；ㄇ嗨靥腔D(zhuǎn)移酶在不同植物中活性不同。同一株植物的不同組織部位，花青素糖基轉(zhuǎn)移酶活性也不同。通常越稚嫩的部位，花青素糖基轉(zhuǎn)移酶活性越高。本研究有類似發(fā)現(xiàn)，AmGT1在金魚草根、莖、葉中均有表達，但相對表達量較低，這與金魚草根、莖、葉中花青素含量較低有關(guān)；而AmGT1表達量葉片>莖>根，說明AmGT1存在明顯組織表達差異性。AmGT1基因在紅、粉、黃、白4種花色金魚草中都有表達，但紅色花的表達量顯著高于其它顏色，白色花表達水平一直較低，這表明AmGT1是植物花朵呈現(xiàn)紅色的重要基因。同一種顏色花朵，紅花、粉花的表達量，中、后期（松蕾期、初開期、盛開期）顯著高于前期；這個緊蕾期到松蕾期的躍變表明蕾期AmGT1的表達對花朵顯色影響較大。

葡萄UF3GT在體外不僅能利用花青素類作為糖基受體，還能利用黃酮醇等化合物作為底物[16]；甜菊體內(nèi)GTs既可以對類黃酮轉(zhuǎn)糖基，同時還生成甜菊糖苷，不具有嚴格的底物特異性[17]。AmGT1表達是否具有底物特異性，對于利用基因工程改變金魚草花青素相關(guān)基因表達，進一步研究該基因酶在生物體外以糖基化的形式存在并被保存，從而提高其保健價值具有重要意義，需進一步深入研究。

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