趙龍 周賢軒

摘要 [目的]獲得大腸桿菌的 Ⅱ 型丙酮酸激酶。[方法]首先用MEGA7軟件對(duì)不同生物丙酮酸激酶的編碼基因進(jìn)行聚類分析；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增了大腸桿菌的 Ⅱ 型丙酮酸激酶基因pykA，將其克隆到pET28a載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒載體pET28a-pykA并在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了 Ⅱ 型丙酮酸激酶（PykA）的高效表達(dá)；利用鎳柱親和層析系統(tǒng)純化了PykA蛋白，并進(jìn)行了高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)。[結(jié)果]聚類分析結(jié)果表明，大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶與其他原核生物的丙酮酸激酶氨基酸序列具有高度同源性。HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ⅱ型丙酮酸激酶PykA在體外可以高效地將ADP轉(zhuǎn)化為ATP。[結(jié)論]該研究獲得了 Ⅱ 型丙酮酸激酶，為ATP的合成以及 Ⅱ 型丙酮酸激酶為基礎(chǔ)的ATP再生系統(tǒng)的研究提供了參考。

關(guān)鍵詞 Ⅱ 型丙酮酸激酶；蛋白表達(dá)；高效液相色譜；大腸桿菌；ATP再生系統(tǒng)

中圖分類號(hào) Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）25-0142-03

Abstract [Objective] The aim was to obtain the type Ⅱ pyruvate kinase of E.coli.[Method] The phylogenetic analysis using MEGA7 software showed high similarity between the a mino acid sequence of type Ⅱ pyruvate kinase in Escherichia coli and that of other bacteria.Then，the pykA gene encoding type Ⅱ pyruvate kinase of E.coli was amplified by using Polymerase Chain Reaction （PCR），cloned into the pET28a vector，and overexpressed in the host strain E.coli BL21.The resultant product was purified by nickel affinity chromatography，and detected by high performance liquid chromatography （HPLC）.[Result] HPLC analysis revealed that PykA efficiently converted ADP to ATP in vitro.[Conclusion] The progress in expression，purification and activity deter mination of type Ⅱ pyruvate kinase will contribute to ATP production and biosynthesis based on the ATP regeneration system.

Key words Pyruvate kinase Ⅱ；Protein expression；High performance liquid chromatography；Escherichia coli；ATP regeneration system

丙酮酸激酶廣泛分布于微生物、動(dòng)物和植物體內(nèi)，是糖酵解途徑重要的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，參與了糖酵解途徑的底物水平磷酸化反應(yīng)[1]。丙酮酸激酶的國(guó)際酶學(xué)編號(hào)為EC2.7.1.40，又稱為磷酸丙酮酸激酶、丙酮酸磷轉(zhuǎn)移酶，該酶在同一個(gè)有機(jī)體中存在多種同工酶[2]。在細(xì)菌中通常有2種丙酮酸激酶，即 Ⅰ 型PykF丙酮酸激酶和 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。丙酮酸激酶能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到二磷酸腺苷（ADP）上從而生成三磷酸腺苷（ATP）和丙酮酸（PYR）[3]。ATP的合成與再生在工業(yè)生產(chǎn)與科學(xué)研究工作中有重要價(jià)值。丙酮酸激酶催化的ADP磷酸化生成ATP，可實(shí)現(xiàn)ATP的酶學(xué)方法合成以及生物合成系統(tǒng)中的ATP再生[4]。同時(shí)，以PEP為磷酸基團(tuán)供體，丙酮酸激酶催化的核糖核苷三磷酸再生系統(tǒng)同樣適用于其他5′-三磷酸核苷酸、6-磷酸葡萄糖及各種堿和糖修飾的核苷類似物的合成[5]。在6-磷酸葡萄糖的合成過程中，丙酮酸激酶生成的ATP作為底物被己糖激酶利用，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到葡萄糖上，生成6-磷酸葡萄糖和ADP。該反應(yīng)中的副產(chǎn)物ADP又可以反復(fù)被丙酮酸激酶利用，作為底物重新催化再生合成ATP，從而形成了ADP與ATP相互轉(zhuǎn)化的循環(huán)，不僅節(jié)約成本，還使反應(yīng)更加高效[5]。

據(jù)報(bào)道，不同的NDP作為反應(yīng)底物，在丙酮酸激酶催化的反應(yīng)中動(dòng)力學(xué)常數(shù)往往不同[6]。大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA對(duì)不同的NDP的催化效率由大到小依次為ADP、GDP、CDP、UDP，其中ADP是該酶的最適底物[7]。大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA與大腸桿菌 I 型丙酮酸激酶PykF相比，前者對(duì)ADP的催化效率比后者高出3倍。因此，相對(duì)于PykF來說，在催化ADP磷酸化的ATP酶法合成與ATP再生系統(tǒng)中，Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA是更好的選擇。筆者克隆、表達(dá)并純化了大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA，以期為獲得高純度 Ⅱ 型丙酮酸激酶以及將其應(yīng)用于ATP合成與ATP再生系統(tǒng)等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pET28a由合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院保存；大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）、TOP10購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ、堿性磷酸酶（CIAP）、高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver 2.1購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA提取試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 聚類分析。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索丙酮酸激酶并獲得相應(yīng)的丙酮酸激酶氨基酸序列。這些序列包括了17個(gè)細(xì)菌、真菌及多細(xì)胞生物的丙酮酸激酶氨基酸序列。通過MEGA7軟件，分析了丙酮酸激酶氨基酸序列的同源性，并進(jìn)行聚類制圖。

1.2.2 pET28a-pykA的構(gòu)建。

根據(jù)大腸桿菌pykA基因（GenBank編號(hào)為NZ_CP017979）編碼區(qū)的DNA序列上、下游為同源臂設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上、下游引物分別為5′-CCGCGGATCCATGTCCAGAAGGCTTCGCAG-3′和5′-CCCGCTCGA GTTACTCTACCGTTAAAATACGCGTG-3′。引物兩端引入了限制性酶切位點(diǎn)Xho Ⅰ與BamH Ⅰ。通過聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），以大腸桿菌基因組DNA為模板擴(kuò)增pykA基因，反應(yīng)使用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，利用限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ與BamH Ⅰ進(jìn)行酶切消化，與表達(dá)載體pET28a連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，利用抗性平板（卡那霉素）篩選陽性克隆。

菌落PCR篩選陽性菌落的PCR反應(yīng)使用Taq DNA聚合酶，所用引物分別為5′-CCGCGGATCCATGTCCAGAAGGCTTCGCAG-3′和5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。提取PCR鑒定的陽性菌株質(zhì)粒進(jìn)行Bgl Ⅱ 酶切鑒定。將酶切鑒定符合預(yù)期的質(zhì)粒，命名為pET28apykA，送樣進(jìn)行DNA測(cè)序。然后把序列正確的重組載體pET28apykA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21細(xì)胞，即得到 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的表達(dá)宿主。

1.2.3 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

挑取BL21/pET28apykA單克隆過夜培養(yǎng)。過夜菌液按1∶100接種于1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，OD600為0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，22 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.4 蛋白純化。

將表達(dá)PykA蛋白的1 L菌液5 000 r/min離心20 min，收集細(xì)菌沉淀。用30 mL Solution I（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl）重懸菌體，加入苯甲基磺酰氟（PMSF），用超聲波破碎細(xì)胞（工作時(shí)間5 s，暫停時(shí)間5 s，功率50%，總時(shí)間30 min），4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清，采用Ni親和層析柱純化 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。用Solution Ⅰ 充分平衡Ni親和層析柱，粗蛋白溶液上樣后，用Solution Ⅱ （20 mmol/L TrisHCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑）洗脫雜蛋白，用Solution Ⅲ （20 mmol/L TrisHCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脫，收集洗脫峰，通過SDSPAGE電泳分析目的蛋白純度。蛋白洗脫液共7.5 mL，用截留分子量為10 kDa的半透膜和透析液Solution Ⅳ（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5% Glycerol，5 mmol/L MgCl2）進(jìn)行透析。用Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 HPLC鑒定蛋白活性。

PykA酶活性檢測(cè)在1 mL緩沖溶液中進(jìn)行（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L Na2SO4，10 mmol/L MgCl2，0.05 mg/mL PykA，5 mmol/L PEP-K+，5 mmol/L ADP），30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，并進(jìn)行HPLC檢測(cè)。色譜柱為YMC-Pack Polya mine Ⅱ；洗脫液A為去離子水，洗脫液B為1 mol/L KH2PO4；反應(yīng)產(chǎn)物用1 mol/L KH2PO4溶液進(jìn)行梯度洗脫；在254 nm紫外波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索了17個(gè)細(xì)菌、真菌及多細(xì)胞生物的丙酮酸激酶氨基酸序列。通過MEGA 7軟件，用最大似然法進(jìn)行分析。由圖1可知，丙酮酸激酶的氨基酸序列保守，能夠反映物種進(jìn)化規(guī)律。大腸桿菌的丙酮酸激酶PykF、PykA與其他細(xì)菌，如德氏乳桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌的氨基酸序列同源性更高，體現(xiàn)了更近的親緣關(guān)系。

2.2 pET28a-pykA的構(gòu)建

以大腸桿菌基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增得到了丙酮酸激酶基因。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，DNA片段大小與電泳結(jié)果相符（圖2）。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。用限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ分別對(duì)pykA基因和載體pET28a進(jìn)行限制性酶切、連接并轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中。挑取7個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR檢驗(yàn)，菌落PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如圖3a所示，1～7號(hào)泳道均檢測(cè)出單一條帶，根據(jù)電泳的DNA片段大小，顯示了這7個(gè)克隆均為陽性克隆。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該陽性克隆，又用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取了1個(gè)陽性菌株的質(zhì)粒，并進(jìn)行了Bgl Ⅱ 限制性酶切鑒定。如圖3b所示，酶切后的瓊脂糖凝膠電泳顯示2條DNA條帶，大小與預(yù)期（5 964和814 bp）相符。菌落PCR與酶切檢驗(yàn)均正確的質(zhì)粒送樣測(cè)序，DNA測(cè)序結(jié)果正確，克隆的基因中未發(fā)生堿基突變。

2.3 蛋白表達(dá)與純化

經(jīng)過菌落PCR、酶切及DNA測(cè)序均顯示正確的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，用IPTG誘導(dǎo)過夜。取誘導(dǎo)前后的菌，細(xì)胞破碎后通過SDS-PAGE電泳，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖4a所示，泳道1顯示未誘導(dǎo)細(xì)菌的總蛋白，泳道2為誘導(dǎo)細(xì)菌的總蛋白。結(jié)果顯示誘導(dǎo)后在55 kDa附近有較明顯的蛋白條帶，與 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA蛋白分子量大小一致。為了得到純化的 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA蛋白，利用鎳柱進(jìn)行蛋白純化。如圖4b所示，泳道1為純化前的細(xì)菌蛋白粗液，泳道2為純化后的蛋白，純化后的蛋白只有1條目的蛋白條帶，純化效果很好。利用Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)純化后的目的蛋白PykA進(jìn)行定量，蛋白濃度為2 mg/mL，共從1 L培養(yǎng)液中獲得20 mg純化的 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。

2.4 HPLC鑒定PykA酶活

丙酮酸激酶催化ADP生成ATP。為了 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的活性，在1 mL緩沖溶液中進(jìn)行了酶促催化反應(yīng)，以ADP為底物，在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h后，用高壓液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。圖5a顯示了AMP、ADP、ATP標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為19、32、48 min。取PykA催化ADP生成ATP的反應(yīng)混合物，過濾樣品后通過HPLC進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果見圖5b，反應(yīng)1 h后，反應(yīng)混合物中ATP占97.9%，ADP含量降至2.1%以下，表明在 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的催化作用下，有97.9%的ADP被轉(zhuǎn)化生成ATP。

3 結(jié)論

構(gòu)建了大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的原核表達(dá)載體pET28-pykA，并在宿主大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。經(jīng)過Ni親和層析柱純化得到高純度的 Ⅱ 型丙酮酸激酶。該酶可以在1 h內(nèi)將5 mmol/L ADP轉(zhuǎn)化為ATP，轉(zhuǎn)化效率為97.9%，顯示了大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的良好催化能力。該工作為ATP酶法合成及ATP再生系統(tǒng)等后續(xù)研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]VALENTINI G，LADAROLA P，SOMANI B，et al.Two forms of pyruvate kinase in Escherichia coli.A comparison of chemical and molecular properties[J].Biochim et Biophys Acta，1979，570（2）：248-258.

[2] SRIVASTAVA L K，BAQUER H Z.Purification and properties of rat brain pyruvate kinas[J].Arch Biochem Biophys，1985，236（2）：703-713.

[3] KUMAR S，BARTH A.Phosphoenolpyruvate and Mg2+ binding to pyruvate kinase monitored by infrared spectroscopy[J].Biophys J，2010，98（9）：1931-1940.

[4] ZHANG X，WU H，HUANG B，et al.Onepot synthesis of glutathione by a twoenzyme cascade using a thermophilic ATP regeneration system[J].J Biotechnol，2017，241：163-169.

[5] YAN B K，DING Q B，OU L，et al.Production of glucose6phosphate by glucokinase coupled with an ATP regeneration system[J].World J Microbiol Biotechnol，2014，30（3）：1123-1128.

[6] CHATTERTON T A，REYNOLDS C H，LAZARUS N R，et al.Immunological and kinetic properties of pyruvate kinase in rat pancreatic islets[J].Biochem J，1982，204（2）：605-608.

[7] GIBRIEL A Y，DOELLE H W.Investigation into pyruvate kinases from Escherichia coli K12 grown under aerobic and anaerobic conditions[J].Microbios，1975，12（50）：179-197.