周麗霞　吳翼　肖勇

摘要：【目的】應(yīng)用SSR分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)油棕品種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性分析，以期通過(guò)分析具有高雜合度油棕品種的遺傳結(jié)構(gòu)來(lái)輔助育種?！痉椒ā坷肧SR分子標(biāo)記及PCR銀染顯色技術(shù)篩選多態(tài)性引物，分析8個(gè)油棕品種的等位基因頻率（P）、觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He），計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)座子的平均等位基因（Na）、每個(gè)多態(tài)轉(zhuǎn)座子的平均等位基因數(shù)（Na/pl）及有效等位基因數(shù)（Ne），計(jì)算固定指數(shù)（Fis）和F-統(tǒng)計(jì)量值（Fit和Fst），并基于遺傳距離對(duì)8個(gè)油棕品種進(jìn)行聚類分析。【結(jié)果】開(kāi)發(fā)出27對(duì)多態(tài)性SSR引物，從中選取15對(duì)結(jié)果較好的多態(tài)性引物對(duì)油棕大樣本進(jìn)行檢測(cè)，挖掘出57個(gè)等位基因（Na），平均每個(gè)轉(zhuǎn)座子的Na為3.8個(gè)，表明8個(gè)油棕品種的遺傳變異較明顯。平均有效等位基因數(shù)（Na）和期望雜合度（He）分別為0.6248和0.5902。此外，發(fā)現(xiàn)一個(gè)高水平的種群分化，F(xiàn)-統(tǒng)計(jì)量值（Fst）變化范圍為0.1029～0.6010，平均為0.3664。利用多態(tài)性SSR分析8個(gè)油棕品種的遺傳距離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種1和品種3的遺傳距離最遠(yuǎn)（1.674），品種3和品種5的遺傳距離最近（0.065）。【結(jié)論】8個(gè)油棕品種的多態(tài)性相對(duì)豐富，物種間雜交程度較小，物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳多樣性良好。

關(guān)鍵詞： 油棕；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；遺傳距離

中圖分類號(hào)： S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）02-0216-06

Abstract：【Objective】The present study conducted genetic structure and genetic diversity analysis on eight Elaeis guineensis Jacq. varieties using SSR molecular marker， in order to provide references for breeding through analyzing genetic structure of E. guineensis Jacq. varieties with high levels of heterozygosity. 【Method】Using SSR molecular marker and PCR silver-stain technique， the researchers analyzed allele frequencies（P），observed heterozygosities（Ho） and expected heterozygosities（He）， calculated mean number of alleles per transposons（Na）， mean number of alleles per polymorphic transposons（Na/pl） and number of effective alleles（Ne）. Fixation index（Fis） and F-statistic values（Fit and Fst） were also calculated. Clustering analysis on eight E. guineensis Jacq. varieties was conducted based on genetic distance. 【Result】Twenty-seven pairs of polymorphic SSR primers were developed，fifteen pairs of polymorphic primers with good results were selected for testing E. guineensis Jacq. large sample. Fifty-seven alleles（Na） were detected，and Na per transposons was 3.8 on average， which showed that the genetic variation of eight E. guineensis Jacq. varieties was obvious. Average effective alleles（Ne） was 0.6248 and expected heterozygosity（He） 0.5902. A high-level population differentiation was found， F-statistic value（Fst） ranging from 0.1029 to 0.6010 and being 0.3664 on average. Polymorphism SSR was applied to analyze genetic distance of the eight E. guineensis Jacq. varieties. The results indicated that genetic distance between Variety 1 and Variety 3 was the longest（1.674）， and genetic distance between Variety 3 and Variety 5 was the shortest（0.065）. 【Conclusion】The eight E. guineensis Jacq. varieties enjoy abundant polymorphism， small hybridization degree between species， far species polygenetic relationship and sound genetic diversity.

Key words： Elaeis guineensis Jacq.； SSR marker； genetic diversity； genetic distance

0 引言

【研究意義】油棕（Elaeis guineensis Jacq.）屬棕櫚科單子葉多年生木本油料作物，在我國(guó)海南、廣西等?。▍^(qū)）均有種植，其果實(shí)含油量較高，具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值（熊惠波等，2010）。種質(zhì)資源的豐富程度是影響油棕產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一，而遺傳多樣性決定種質(zhì)資源的豐富度，也是物種和個(gè)體適應(yīng)外界環(huán)境和進(jìn)化的前提（Bracco et al.，2009）。近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展為植物遺傳多樣性分析和品種鑒定提供了新思路，其中，SSR分子標(biāo)記具有單堿基高分辨率、可檢測(cè)等位基因、所需DNA樣本量少和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)（Eujay et al.，2004；Blair et al.，2011），被認(rèn)為是進(jìn)行植物遺傳研究最理想的分子標(biāo)記。因此，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)考察油棕的遺傳多樣性，可為其育種資源的選擇及遺傳改良提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SSR是用于物種遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種的重要標(biāo)記之一。詹永發(fā)等（2015）采用形態(tài)學(xué)和SSR標(biāo)記聚類分析法將貴州97個(gè)辣椒種質(zhì)資源分成五大類群， 為進(jìn)一步發(fā)掘和利用當(dāng)?shù)刎S富的辣椒品種資源提供了參考依據(jù)；趙君等（2015）利用均勻分布于棉花26條染色體上的370對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)32個(gè)棉花品種（系）進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)高含油量品種（系）與低含油量品種（系）的遺傳差異明顯，遺傳距離遠(yuǎn)，其中高含油量種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)較豐富；高旭等（2016）利用SSR分子標(biāo)記對(duì)全國(guó)156份籽粒高粱進(jìn)行全基因組基因分型，并通過(guò)聚類分析和主坐標(biāo)分析將156份高粱資源劃分為三大類群，為粒用高粱資源的科學(xué)利用和新品種選育提供了參考；Zhao等（2016）利用74對(duì)SSR引物對(duì)134份耐鹽處理的棉花樣本進(jìn)行分析，開(kāi)發(fā)出8對(duì)耐鹽相關(guān)SSR分子標(biāo)記，為協(xié)助棉花的分子輔助育種工作打下了基礎(chǔ)。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了目標(biāo)性狀相關(guān)SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用，如Xiao等（2014）通過(guò)分析油棕對(duì)照組和冷處理組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，找到5791個(gè)SSR位點(diǎn)，在182對(duì)多態(tài)性SSR引物中有137對(duì)可定位到油棕染色體上，同時(shí)，通過(guò)分析油棕低溫處理組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)ICE1同源基因、5個(gè)CBF同源基因、19個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子和4個(gè)冷誘導(dǎo)同源基因；Zhang等（2014）通過(guò)挖掘454組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)了57對(duì)可用于分析黃鲇魚(yú)群體結(jié)構(gòu)的EST-SSR分子標(biāo)記；Feng等（2016）通過(guò)分析藥用杭白菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，新開(kāi)發(fā)了17對(duì)EST-SSR分子標(biāo)記，并對(duì)32個(gè)杭白菊栽培品系進(jìn)行了基因多樣性分析，顯示SSR分子標(biāo)記技術(shù)可根據(jù)起源及生態(tài)分布用于杭白菊分類分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】遺傳多樣性很大程度上決定著生物多樣性，但目前我國(guó)對(duì)油棕遺傳結(jié)構(gòu)及群體多樣性的研究相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)分析油棕轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，挖掘可用于評(píng)價(jià)油棕品種遺傳多樣性的SSR分子標(biāo)記，并利用SSR分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)油棕品種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性分析，以期通過(guò)分析具有高雜合度油棕品種的遺傳結(jié)構(gòu)來(lái)輔助育種。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料及其DNA提取

8個(gè)油棕品種分別采自云南、廣西和海南（表1）。采用盆栽方法，塑料盆體高約40 cm，直徑約30 cm，每盆裝土約7.5 kg。油棕為半年生實(shí)生苗，同一期培育，植株大小相近，高約70 cm，地徑30～35 cm，每品種20盆，每盆1株。采集油棕嫩葉，每株采集1份葉片，每品種采樣20份，采用CATB法提取葉片DNA（周麗霞等，2013），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 油棕轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和SSR位點(diǎn)分析

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到51452條油棕轉(zhuǎn)錄組序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，找到5791個(gè)SSR位點(diǎn)，平均10個(gè)表達(dá)序列中含有1個(gè)SSR位點(diǎn)。應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并隨機(jī)選取100對(duì)進(jìn)行篩選。其中引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為：（1）引物長(zhǎng)度在18～25 bp；（2）退火溫度在55～60 ℃；（3）GC最佳含量在50%左右，盡量避免出現(xiàn)引物二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體；（4）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)在100～300 bp。

1. 3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系10.0 μL：10×Buffer（Mg2+） 1.0 μL，1 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，dNTP MIX 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，ddH2O 5.6 μL，50 ng/μL DNA模板2.0 μL，向體系中加入10.0 μL無(wú)菌液體石蠟油，在TP1600梯度PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58.4 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。最后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，銀染顯色。

1. 4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)找到表達(dá)差異在2倍以上的基因，應(yīng)用Mastfinder分析基因序列SSR位點(diǎn)，并采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用POPGENE 1.32進(jìn)行8個(gè)油棕品種的遺傳多樣性分析，包括等位基因頻率（P）、觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He），計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)座子的平均等位基因（Na）、每個(gè)多態(tài)轉(zhuǎn)座子的平均等位基因數(shù)（Na/pl）及有效等位基因數(shù)（Ne），同時(shí)計(jì)算固定指數(shù)（Fis）和F-統(tǒng)計(jì)量值（Fit和Fst）（Nei，1973；Eloi et al.，2012）。采用UPGMA制圖評(píng)估不同品種間的遺傳距離（Wright，1965）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SSR引物篩選及8個(gè)油棕品種多態(tài)性分析結(jié)果

從160份油棕樣本中隨機(jī)選取24份，對(duì)100對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選分析，其中73對(duì)引物的PCR結(jié)果為1條條帶，27對(duì)引物呈多態(tài)性（部分PCR結(jié)果見(jiàn)圖1）。由圖1可看出，油棕樣本PCR目標(biāo)條帶清晰，且均存在2條以上條帶，大小與預(yù)期值相符，該結(jié)果初步表明引物多態(tài)性較好。從中選取結(jié)果較好的15對(duì)引物（表2）進(jìn)行大樣本檢測(cè)，引物多態(tài)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。

選取15對(duì)引物對(duì)油棕大樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表3）共挖掘出57個(gè)等位基因（Na），平均每個(gè)轉(zhuǎn)座子的Na為3.8個(gè)。有效等位基因數(shù)（Ne）和期望雜合度（He）在15個(gè)SSR中存在較大差異，Ne最大值（4.3189）和He最大值（0.8630）出現(xiàn)在具有三堿基重復(fù)[（CTC）6]單元的SSR11，Ne最小值（1.5936）和He最小值（0.3305）出現(xiàn)在具有三堿基重復(fù)[（TCC）5]單元的SSR5。所有SSR的Ne平均值為2.6248，He平均值為0.5902。較大的Ne和He（>0.50）出現(xiàn)在12個(gè)SSR轉(zhuǎn)座子中（SSR1～SSR4、SSR6和SSR8～SSR14），表明80%的SSR轉(zhuǎn)座子可完成對(duì)8個(gè)油棕群體的區(qū)分。8個(gè)SSR轉(zhuǎn)座子（53.34%）的固定指數(shù)（Fis）是正值，負(fù)值出現(xiàn)在SSR3、SSR6和SSR9～SSR13，表明46.66%的雜交群體中有SSR轉(zhuǎn)座，該雜交群體存在大量的遺傳變異。F-統(tǒng)計(jì)量值（Fst）可用于評(píng)估油棕品種的分化水平，8個(gè)油棕品種的Fst變化較明顯，為0.1029～0.6010，平均為0.3664，表明36.64%等位基因頻率的變化是由8個(gè)油棕品種的遺傳差異所引起。

3 討論

常用的分子標(biāo)記技術(shù)，如AFLPs、RAPDs和RFLP等已在油棕基因型分析、挖掘與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記等方面得到廣泛應(yīng)用（Billotte et al.，2005；Cochard et al.，2009），但這些分子標(biāo)記技術(shù)均是通過(guò)電泳技術(shù)進(jìn)行基因型分型，分析的數(shù)據(jù)量相對(duì)較少，通量較低。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合生物信息學(xué)分析，多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)更快速和高效。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于開(kāi)發(fā)與目標(biāo)性狀緊密相聯(lián)的SSR分子標(biāo)記（Das and Rao，2015； Kumar et al.，2015），為分子遺傳育種、群體多樣性分析及遺傳結(jié)構(gòu)鑒定打下了基礎(chǔ)。越來(lái)越多的研究者通過(guò)對(duì)油棕進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)解讀與重要農(nóng)業(yè)性狀相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)理，并挖掘了大量的ESTs（Tranbarger et al.，2011），如Low等（2008）為了解在油棕組織培養(yǎng)過(guò)程中的基因表達(dá)情況，開(kāi)發(fā)了648條與組織培養(yǎng)相關(guān)聯(lián)的EST-SSRs，為體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)聯(lián)的候選基因鑒定提供了條件。

目前，我國(guó)的油棕資源主要分布在海南、廣西等地，種植面積雖較廣，但對(duì)油棕種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)、雜交度等方面的評(píng)估相對(duì)較少，可用于分析其遺傳結(jié)構(gòu)多樣性的SSR分子標(biāo)記數(shù)量十分有限，在很大程度上制約著我國(guó)油棕遺傳育種的進(jìn)程，進(jìn)而限制了油棕產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。肖勇等（2013）應(yīng)用NCBI網(wǎng)站上公布的EST序列對(duì)18份油棕資源進(jìn)行SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有25個(gè)油棕SSR標(biāo)記具有中度多樣性。本研究以收集的8個(gè)油棕品種（160份油棕樣本）為基礎(chǔ)研究材料，通過(guò)高通量測(cè)序獲得油棕轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100對(duì)引物中有27對(duì)多態(tài)性SSR引物序列，通過(guò)PCR結(jié)果初步判斷引物具有明顯多態(tài)性。從中選擇15對(duì)引物對(duì)8個(gè)品種進(jìn)行SSR多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，8個(gè)油棕群體的Ho和He分別為0.1174～0.9261和0.2346～ 0.5547，變化范圍較大，說(shuō)明油棕品種的遺傳多樣性豐富；同時(shí)，對(duì)8個(gè)油棕品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明8個(gè)油棕品種的多態(tài)性相對(duì)豐富，物種間雜交程度不明顯，物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。與肖勇等（2013）的研究結(jié)果相比，本研究中油棕轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過(guò)高通量測(cè)序獲得，相對(duì)從NCBI網(wǎng)站下載公布的EST序列來(lái)說(shuō)，數(shù)據(jù)量變大，分析更全面準(zhǔn)確，且油棕樣本是從云南、廣西和海南3個(gè)不同地點(diǎn)收集而來(lái)，樣本來(lái)源較豐富，相對(duì)能代表我國(guó)油棕現(xiàn)有的種植情況和群體結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果較系統(tǒng)地分析了國(guó)內(nèi)油棕資源的遺傳結(jié)構(gòu)，明確了品種的多樣性，為油棕的遺傳育種工作打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了27對(duì)多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，并從中選擇15對(duì)多態(tài)性較好的SSR分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)油棕品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)油棕品種間雜交程度很小，遺傳多樣性良好。該結(jié)論可為油棕育種資源的挖掘及分子輔助育種提供參考。

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（責(zé)任編輯 王 暉）