楊劍　尹丹　郝祝兵　譚紅連　韋英益　曾蕓　胡庭俊

摘要：【目的】探討豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）感染量、感染時間與被感染RAW264.7細胞活性氧水平動態(tài)變化的相關(guān)性，為建立RAW264.7細胞氧化脅迫體外模型提供參考依據(jù)。【方法】PCV2原液調(diào)至5×106/mL，經(jīng)10、102、103和104倍稀釋（10-1、10-2、10-3和10-4稀釋度）后，感染作用RAW264.7細胞2 h，棄病毒液，加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于第4、8、12、24和48 h收集細胞上清液或細胞，測定一氧化氮（NO）、活性氧自由基（ROS）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、髓過氧化物酶（MPO）和誘生型一氧化氮合酶（iNOS）等指標。【結(jié)果】10-1 PCV2感染RAW264.7細胞后能有效升高細胞NO、ROS水平，降低細胞GSH水平和GSH/GSSG，升高細胞XOD、MPO和iNOS活性，表明以10-1 PCV2感染RAW264.7細胞一定程度上能改變細胞氧化還原狀態(tài)，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。【結(jié)論】PCV2感染能誘導(dǎo)RAW264.7細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，并確立10-1 PCV2（5×105/mL）體外感染RAW264.7細胞4～24 h是建立RAW264.7細胞氧化脅迫模型的最佳條件。

關(guān)鍵詞： 豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）；RAW264.7細胞；氧化應(yīng)激；模型

中圖分類號： S858.28 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0151-07

Abstract：【Objective】The present study investigated the relationship between infection dose， infection time of porcine circovirus type 2（PCV2） and dynamic changes of reactive oxygen species（ROS） levels in PCV2 infected RAW264.7 cells， so as to provide a reference for the establishment of in vitro oxidative stress model of RAW264.7 cell. 【Method】 PCV2 virus liquid of 5×106/mL was prepared， and was 10， 102， 103 and 104 times diluted（10-1， 10-2， 10-3， 10-4 dilutions） before use. RAW264.7 cells were infected with five different concentrations of PCV2 for 2 hours， and then virus liquids were discarded. The cells were cultured in DMEM after adding 5% FBS for 4， 8， 12， 24 and 48 h. Cell supernatant or cells were collected and levels of nitric oxide（NO）， reactive oxide species（ROS）， reduced glutathione（GSH）， oxidized glutathione（GSSG）， xanthine oxidase（XOD）， myeloperoxidase（MPO） and inducible nitric oxide synthase（iNOS） were determined. 【Result】After 10-1 PCV2 infected RAW264.7 cells， levels of NO and ROS increased while GSH levels and GSH/GSSG ratio decreased. Activities of XOD， MPO and iNOS also increased. These findings suggested that 10-1 PCV2 infection could change cellular redox state and induce cells to produce oxidative stress. 【Conclusion】PCV2 infection can induce oxidative stress in RAW264.7 cells. 10-1 PCV2（5×102/mL） infection in vitro on RAW264.7 cells for 4-24 h is the optimum condition for establishing oxidative stress model.

Key words： porcine circovirus type 2（PCV2）； RAW264.7 cell； oxidative stress； model

0 引言

【研究意義】豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning mutisystenic wasting syndrome，PMWS）的主要致病原，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失（Jiang et al.，2012；楊利勇等，2015）。PCV2復(fù)制的主要場所是單核—巨噬細胞和抗原提呈細胞，從其感染病豬的肺臟、肝臟、腎臟、扁桃體、胸腺、外周血單核細胞、支氣管淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)中均能檢測到PCV2（Yu et al.，2007），即造成病豬免疫系統(tǒng)受損、免疫能力下降。動物機體的氧化還原狀態(tài)與機體疾病的發(fā)生和發(fā)展存在密切聯(lián)系。氧化應(yīng)激是指動物機體在遭受內(nèi)源性或外源性有害刺激時，機體高活性分子如活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多，氧化程度超過機體自身清除氧化性物質(zhì)的能力而導(dǎo)致組織損傷（呂進和王希良，2009）。因此，加強PCV2感染所致免疫細胞氧化應(yīng)激模型研究對揭示其致病機理具有重要意義。【前人研究進展】近年來，不同細胞氧化應(yīng)激模型的研究逐漸增多。趙曙光等（2011）在研究不同濃度葡萄糖氧化酶（GO）對人類肝細胞L02氧化應(yīng)激水平的影響時，發(fā)現(xiàn)GO引起的肝細胞氧化應(yīng)激損傷呈劑量依賴性，其中100 U/L是建立肝細胞氧化應(yīng)激的適宜濃度。齊曉龍等（2013）以不同濃度過氧化氫（H2O2）作用產(chǎn)蛋雞肝細胞1、2、4 h和24 h后，測定肝細胞的相對存活率、胞內(nèi)丙二醛（MDA）和ROS含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以4 mmol/L H2O2處理肝細胞2 h可構(gòu)建產(chǎn)蛋雞原代肝細胞氧化應(yīng)激模型。楊玉霞等（2015）成功建立了體外叔丁基過氧化氫小梁網(wǎng)細胞氧化應(yīng)激模型，可應(yīng)用于青光眼氧化應(yīng)激研究。有關(guān)病毒感染所致細胞氧化應(yīng)激模型的建立也有報道，如Chen等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染PK-15細胞能促進ROS產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而ROS的產(chǎn)生反過來促進PCV2復(fù)制，表明PCV2在感染宿主細胞及復(fù)制的過程中會破壞細胞氧化還原狀態(tài)平衡，而宿主細胞氧化還原狀態(tài)的改變又能影響病毒的感染和復(fù)制。至今，國內(nèi)外關(guān)于PCV2實驗性感染BALB/c小鼠、昆明系小鼠模型的研究逐漸增多。Kiupel（2001）、Quintana等（2002）、趙路易等（2007）、羅玉均等（2008）先后通過腹腔注射PCV2感染BALB/c小鼠，在其血清、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織均成功檢測到PCV2。苗嵐飛等（2008）、Li等（2010）、Deng等（2011）、鄧治邦等（2012）以PCV2感染昆明小鼠后，在感染昆明小鼠的多個臟器內(nèi)均可檢出PCV2，成功構(gòu)建了PCV2感染昆明系鼠模型。此外，Cságola等（2008）、Opriessnig等（2009）研究表明，在PCV2實驗性感染不同品系小鼠血液中能檢測到PCV2，但感染小鼠未表現(xiàn)出任何病理變化?！颈狙芯壳腥朦c】PCV2實驗性感染仔豬的研究已取得一定進展，有關(guān)PCV2與其他病原微生物（豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬肺炎支原體、豬細小病毒等）混合感染建立感染動物模型的報道也較多（Okuda et al.，2003；Opriessnig et al.，2004；Lager et al.，2007），但單一利用PCV2感染復(fù)制出PMWS的研究鮮見報道，尤其關(guān)于PCV2感染所致免疫細胞氧化應(yīng)激模型的建立尚無報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過PCV2體外感染小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞，測定感染細胞分泌一氧化氮自由基（NO）的水平、細胞內(nèi)總活性氧（ROS）水平、還原型谷胱甘肽（GSH）含量、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量、黃嘌呤氧化酶（XOD）活性、髓過氧化物酶（MPO）活性、誘生型一氧化氮合酶（iNOS）活性，旨在探討PCV2感染量、感染時間與RAW264.7細胞活性氧水平動態(tài)變化的相關(guān)性，為建立RAW264.7細胞氧化脅迫體外模型提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

PCV2 SH毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室提供，經(jīng)PK-15細胞增殖后測得病毒滴度為104 TCID50/0.1 mL；PCV2特異性引物采用Primer Premier 5.0進行設(shè)計，由Invitrogen公司合成。豬腎傳代細胞系PK-15細胞由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室提供，RAW264.7細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫，南美洲胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，XOD、MPO、iNOS活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，噻唑藍（MTT）、鄰苯二甲醛（OPT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）購自北京索萊寶科技有限公司，萘乙烯二胺購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，對氨基苯磺酸購自天津市福晨化學(xué)試劑廠。主要儀器設(shè)備有UV1750型紫外可見光分光光度計、Multimode Plate Reader多功能酶標儀、S1000梯度PCR儀、C150細胞培養(yǎng)箱、TS100-F倒置顯微鏡等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 細胞分離培養(yǎng)及處理 RAW264.7細胞復(fù)蘇后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106/mL鋪于24孔板（1.0 mL/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)貼壁后棄上清液，加入PCV2 200 μL，于37 ℃、5% CO2下再孵育2 h，PBS洗滌2次，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)4、8、12、24和48 h。細胞處理結(jié)束后棄上清液，PBS洗滌3次，收集細胞，嚴格按照試劑盒說明提取DNA，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 2. 2 試驗分組及處理 分別設(shè)細胞對照組和5個不同濃度（100、10-1、10-2、10-3和10-4稀釋度）PCV2感染組。病毒原液調(diào)至5×106/mL，分別進行10、102、103和104倍稀釋。細胞對照組加入無血清DMEM培養(yǎng)液200 μL，各病毒組加入等量不同濃度病毒液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄病毒液，PBS洗滌3次后每孔加入1.0 mL含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于第4、8、12、24和48 h收集細胞上清液或細胞，用于NO、ROS、GSH、GSSG、XOD、MPO和iNOS等指標測定。

1. 2. 3 MTT法檢測細胞活性 細胞培養(yǎng)44 h后吸出110 μL上清液，加入10 μL的5 g/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后棄上清液，加入100 μL DMSO，室溫避光靜置10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD450 nm。

1. 2. 4 Griess法檢測上清液中NO含量 細胞分別培養(yǎng)4、8、12和24 h后，收集細胞上清液（100 μL），加入100 μL Griess試劑，室溫避光反應(yīng)10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD450 nm，根據(jù)NaNO2標準曲線計算NO含量。

1. 2. 5 DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平 細胞分別培養(yǎng)4、8、12、24和48 h后，棄上清液，每孔加入0.5 mL的10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，孵育30 min后棄上清液，PBS洗滌3次，加入1.0 mL PBS，收集細胞200 μL于96孔黑板中，于熒光酶標儀測定熒光值（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）。

1. 2. 6 OPT熒光法檢測細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài) 分別于細胞處理4、8、12、24和48 h后收集細胞，加入400 μL的5%三氯醋酸，冰水浴超聲破碎1 min，于4 ℃下12000×g離心15 min，取上清液分裝，-80 ℃保存。GSH測定：取200 μL上清液加入3.6 mL PBS-EDTA（pH 8.0）和200 μL OPT，混勻，室溫孵育40 min，于熒光酶標儀測定熒光值（激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長425 nm），并根據(jù)標準曲線計算GSH含量。GSSG測定：取100 μL上清液加入40 μL NEM（0.04 mol/L）室溫孵育30 min，再加入1.9 mL NaOH（0.1 mol/L）和100 μL OPT（1 mg/mL），混勻，室溫孵育15 min，于熒光酶標儀測定熒光值（激發(fā)波長337.8 nm，發(fā)射波長421.6 nm），并根據(jù)標準曲線計算GSSG含量。

1. 2. 7 細胞內(nèi)XOD、MPO及iNOS活性檢測 分別于細胞處理4、8、12、24和48 h后棄上清液，收集細胞，2000×g離心5 min，棄上清液，PBS洗滌3次，再加入0.5 mL PBS，超聲破碎后10000×g離心10 min，取上清液，嚴格按照測定試劑盒說明進行XOD、MPO及iNOS活性檢測。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCV2感染RAW264.7細胞的結(jié)果

圖1顯示，PCV2感染RAW264.7細胞4、8、12、24和36 h后，抽提病毒DNA，經(jīng)PCR擴增均能得到特異性條帶，感染后48 h所得特異性條帶較弱，而感染后2和72 h未能擴增獲得特異性條帶。說明PCV2能成功感染RAW264.7細胞，但感染時間宜控制在4～36 h。

2. 2 PCV2感染對RAW264.7細胞活性的影響

如圖2所示，PCV2原液感染RAW264.7細胞能極顯著降低細胞活性（P<0.01，下同），其余各濃度的PCV2感染RAW264.7細胞活性也有一定程度的降低，但與細胞對照組相比差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 3 PCV2感染RAW264.7細胞對NO分泌的影響

如圖3所示，不同濃度PCV2感染RAW264.7細胞后，隨著感染時間的延長細胞分泌NO水平逐漸升高，其中10-1 PCV2感染RAW264.7細胞24和48 h后細胞分泌NO水平較細胞對照組顯著升高（P<0.05，下同）。表明PCV2感染RAW264.7細胞能促進其分泌NO。

2. 4 PCV2感染RAW264.7細胞對ROS產(chǎn)生的影響

如圖4所示，PCV2感染RAW264.7細胞24 h內(nèi)，ROS水平隨感染時間的延長呈逐漸升高趨勢，但至感染后48 h時顯著降低。以10-1 PCV2感染RAW264.7細胞后，其細胞內(nèi)ROS水平在各時間點均顯著高于細胞對照組。

2. 5 PCV2感染RAW264.7細胞對細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響

如圖5-A所示，PCV2感染RAW264.7細胞能降低其細胞內(nèi)GSH水平。其中，10-1 PCV2感染RAW264.7細胞8、12和24 h后能有效降低細胞內(nèi)GSH水平，與細胞對照組的差異極顯著；10-2 PCV2感染RAW264.7細胞8和24 h后細胞內(nèi)GSH水平也極顯著低于細胞對照組，感染后12 h細胞內(nèi)GSH水平顯著低于細胞對照組。

如圖5-B所示，PCV2感染RAW264.7細胞后整體上有助于升高其細胞內(nèi)GSSG水平。 其中，PCV2原液感染RAW264.7細胞除在感染4 h后的細胞內(nèi)GSSG水平低于細胞對照組外，其他時間點均高于細胞對照組，且在感染后8和12 h時極顯著高于細胞對照組，感染后48 h時顯著高于細胞對照組；10-1 PCV2感染RAW264.7細胞4、8和12 h后能有效升高細胞內(nèi)GSSG水平，與細胞對照組的差異極顯著，感染24 h后細胞內(nèi)GSSG水平仍顯著高于細胞對照組。

如圖6所示，PCV2感染RAW264.7細胞能降低細胞內(nèi)GSH/GSSG。其中，PCV2原液感染RAW264.7細胞8、12和24 h后細胞內(nèi)GSH/GSSG極顯著低于細胞對照組；與細胞對照組相比，10-1 PCV2、10-2 PCV2和10-3 PCV2感染RAW264.7細胞12和24 h后均能極顯著降低感染細胞內(nèi)GSH/GSSG。

2. 6 PCV2感染RAW264.7對XOD活性的影響

如圖7所示，PCV2感染RAW264.7細胞后整體上有提高細胞XOD活性的趨勢。其中，PCV2原液感染RAW264.7細胞12和24 h后細胞XOD活性顯著高于細胞對照組；10-1 PCV2感染RAW264.7細胞8、12、24和48 h后細胞XOD活性顯著或極顯著高于細胞對照組。

2. 7 PCV2感染RAW264.7細胞對MPO活性的影響

如圖8所示，PCV2感染RAW264.7細胞后能有效提高細胞MPO活性，但隨著培養(yǎng)時間的延長細胞MPO活性整體上呈逐漸降低趨勢。其中，PCV2原液感染RAW264.7細胞后細胞MPO活性顯著高于細胞對照組，且在感染4 h時差異達極顯著水平；10-1 PCV2感染RAW264.7細胞后的MPO活性在感染后8 h時極顯著高于細胞對照組，其他時間點則顯著高于細胞對照組。

2. 8 PCV2感染RAW264.7細胞對iNOS活性的影響

如圖9所示，PCV2感染RAW264.7細胞后整體上能提高細胞iNOS活性，且以10-1 PCV2感染RAW264.7細胞的提高效果最明顯，各時間點的感染細胞iNOS活性均顯著或極顯著高于細胞對照組。

3 討論

病毒感染是引發(fā)多種動物疾病的直接原因，與自由基堆積導(dǎo)致的氧化損傷密切相關(guān)。一方面，病毒感染引起細胞ROS累積，促使吞噬細胞活化并釋放氧化性細胞因子，如TNF和IL-1等（呂進和王希良，2009）。已有研究表明，許多病毒都能引起多種細胞大量釋放ROS（劉倩等，2011），包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人體免疫缺損病毒、呼吸道合胞病毒和流感病毒等。另一方面，病毒感染產(chǎn)生的ROS在疾病進程中能激活動物機體的免疫系統(tǒng)，在對抗細胞損傷方面起正調(diào)節(jié)作用（Gruhne et al.，2009）。在正常生理條件下，動物機體通過維持氧化物/抗氧化物的平衡以保持體內(nèi)的正常狀態(tài)，病毒感染時，病毒通過改變細胞氧化物與抗氧化物的平衡，影響細胞凋亡過程，從而引起機體狀態(tài)的改變。Lim等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒感染可引起機體SOD水平下降、NO水平明顯升高，表明病毒感染誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，釋放大量自由基，在自由基的作用下病毒復(fù)制增強。Chen等（2012）研究表明，PCV2體外感染RAW264.7細胞能顯著升高細胞內(nèi)ROS水平及NO分泌水平，降低GSH水平，誘發(fā)細胞氧化應(yīng)激。Bottero等（2013）研究表明，皰疹病毒感染能使細胞產(chǎn)生ROS放大信號通路而有利于病毒侵入細胞?？梢姡煌瑒游?、免疫細胞氧化應(yīng)激模型的建立是研究病毒感染與氧化應(yīng)激、活性氧間關(guān)系的重要途徑，同時可為開發(fā)緩解病毒感染所致氧化應(yīng)激的藥物提供理論依據(jù)。

RAW264.7細胞作為小鼠的巨噬細胞系，已廣泛應(yīng)用于病毒感染研究（Huang et al.，2008；Hangdo et al.，2011；Lin et al.，2012；Cline et al.，2013）。本研究中，PCV2成功感染RAW264.7細胞，與Su等（2013）的研究結(jié)果一致，且在感染初期（4 h）就對RAW264.7細胞造成影響，感染4～36 h均能通過PCR擴增獲得PCV2特異性條帶；但值得注意的是從48 h開始，其特異性條帶亮度較弱，至72 h時肉眼已經(jīng)無法分辨，因此選擇4～48 h作為后續(xù)研究的時間范圍。通過觀察PCV2感染RAW264.7細胞后細胞NO、ROS、GSH、GSSG水平及MPO、XOD、iNOS活性的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-1 PCV2感染RAW264.7細胞后能有效升高其NO、ROS水平，降低細胞GSH水平和GSH/GSSG，升高細胞XOD、MPO和iNOS活性，表明10-1 PCV2感染RAW264.7細胞一定程度上能改變細胞氧化還原狀態(tài)，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

病毒感染引起ROS釋放，當(dāng)ROS水平超出機體或細胞的清除能力時，即導(dǎo)致?lián)p傷（施志慧等，2012）。本研究結(jié)果表明，PCV2原液（5×106/mL）對氧化應(yīng)激模型的建立不如10-1 PCV2（10倍稀釋），其原因可能是高滴度的PCV2感染RAW264.7細胞后，細胞釋放過多的ROS，雖然已發(fā)生氧化應(yīng)激，但過多的ROS超出了細胞的氧自由基清除能力，最終導(dǎo)致細胞損傷，而不利于氧化應(yīng)激模型建立。同時，本研究發(fā)現(xiàn)在4～24 h范圍內(nèi)，ROS、GSH、GSH/GSSG、XOD、iNOS等指標隨著感染時間的延長呈不同程度的上升趨勢；但超過24 h后（48 h）出現(xiàn)急劇下降。結(jié)合PCV2特異性條帶檢測結(jié)果：在感染4～36 h范圍內(nèi)能檢測到PCV2特異性條帶，但至48 h時其特異性條帶亮度較弱，至72 h時肉眼觀察已無法分辨。因此，推測核酸病毒的強弱與表征氧化應(yīng)激水平的各指標間存在一定關(guān)聯(lián)：核酸病毒的強弱或有無能間接反映PCV2感染的成功與否，在感染后48 h時核酸條帶較弱，說明PCV2感染RAW264.7細胞程度低；感染48 h后ROS、GSH、GSH/GSSG、XOD、iNOS等指標的急劇下降則進一步說明病毒感染程度越高，其氧化應(yīng)激水平越高，但時間并不是病毒感染程度的衡量指標。

4 結(jié)論

PCV2感染能誘導(dǎo)RAW264.7細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，并確立10-1 PCV2（5×105/mL）體外感染RAW264.7細胞4～24 h是建立RAW264.7細胞氧化脅迫模型的最佳條件。該模型可進一步應(yīng)用于PCV2感染與RAW264.7氧化應(yīng)激相關(guān)的研究，為揭示PCV2感染機制和治療方法研究打下基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）