梁湘　李俊　陳慧珠　卓秋紅　龍羽燕　屈達才

摘要：【目的】建立針對家蠶核型多角體病毒（BmNPV）的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）可視化檢測技術(shù)，為生產(chǎn)現(xiàn)場進行家蠶血液型膿病早期診斷提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳訠mNPV多角體蛋白基因polh為擴增靶標，分別設(shè)計5組內(nèi)/外引物和5條環(huán)引物，根據(jù)擴增效率篩選最佳引物組合；優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，并進行LAMP檢測的特異性、敏感性及臨床樣本檢測試驗；使用羥基萘酚藍（HNB）染色對結(jié)果進行比色觀察，對簡化樣品處理的條件進行摸索。【結(jié)果】使用環(huán)引物后LAMP對BmNPV基因組DNA的最低檢測濃度為7 fg/μL，檢測靈敏度得到有效提高，且反應(yīng)時間縮短。建立的LAMP檢測方法對靶標DNA擴增具有特異性，對樣本的檢出率高于常規(guī)PCR，其最低檢測限是常規(guī)PCR的100倍。在反應(yīng)前加入HNB，結(jié)果易判斷且能減少交叉污染。感染家蠶血淋巴進行100 ℃煮沸處理后即可直接用于LAMP反應(yīng)，既簡化了操作步驟，又降低了檢測成本?！窘Y(jié)論】針對BmNPV建立的LAMP可視化檢測技術(shù)具有靈敏、快捷、可靠的特點，適合用于生產(chǎn)現(xiàn)場的BmNPV感染早期診斷。

關(guān)鍵詞： 家蠶核型多角體病毒（BmNPV）；家蠶血液型膿?。籐AMP；早期診斷；可視化

中圖分類號： S884.51 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0163-06

Abstract：【Objective】The present study established loop-mediated isothermal amplification（LAMP） for visual detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）， in order to provide support for early diagnosis of nuclear polyhedrosis at work field. 【Method】Taking BmNPV polyhedrin gene polh as amplification target， five groups of inner primer/outer primer and five pieces of loop primer were designed in order to screen the best primer combination based on amplification efficiency. LAMP reaction conditions were optimized and assays on specificity， sensibility as well as clinical sample detection were conducted. The amplification result was observed by colorimetric determination with hydroxynaphthol blue （HNB） staining. The conditions for simplifying treatment were analyzed. 【Result】When using LAMP of loop primer， the lowest detection line of BmNPV genomic DNA could reach 7 fg/μl， the sensitivity of detection was improved effectively and reaction time was reduced. The established LAMP detection specifically amplified the target DNA， and its sample detection rate was superior to conventional PCR. The lowest detection line was as 100 times as that of conventional PCR. The result could be easily judged and the cross-contamination could be reduced by adding HNB before reaction. The hemolymph of infected silkworm boiled at 100 ℃ could be directly applied to LAMP， which could simplify operation steps and reduce detecting cost. 【Conclusion】The visual LAMP detection targeting BmNPV established in this study is sensitive， quick and reliable， which is appropriate to use for early diagnosis of BmNPV infection at work field.

Key words： Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）； nuclear polyhedrosis； LAMP； early diagnosis； visua-

lization

0 引言

【研究意義】家蠶血液型膿病是廣西養(yǎng)蠶業(yè)中最常見及危害最嚴重的一種病毒性傳染病，由于傳染性強、病死率高，且目前尚無有效的治療方法，對蠶繭生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。家蠶血液型膿病病原為家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV），其特點是病毒粒子可在多角體結(jié)構(gòu)的保護下長期保存感染活力，病毒多角體在自然環(huán)境中廣泛富集，極易對桑葉和蠶作環(huán)境造成污染。BmNPV多角體被蠶體攝食后即引起原發(fā)性感染，繼而傳播感染蠶室內(nèi)的其他健康蠶體（Fuxa，2004；Liang et al.，2013）。因此，建立針對BmNPV的特異、靈敏、快速、適合基層使用的可視化檢測技術(shù)，對有效防控家蠶血液型膿病暴發(fā)流行及減少病毒多角體在生產(chǎn)環(huán)境中的富集具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】分子生物學(xué)診斷技術(shù)是近年來蠶病診斷研究的新方向，主要是基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對病原微生物核酸進行擴增克隆。目前，國內(nèi)已有關(guān)于BmNPV檢測常規(guī)PCR（涂納新等，1994；劉吉平等，2011；唐芬芬等，2013b）、實時熒光定量PCR（姚勤等，2005）、二溫式PCR（覃玥和陳保善，2015）和多重PCR（專利號CN102605106A，浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院）的研究報道；也有關(guān)于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測技術(shù)的報道，但未涉及擴增效率的改善（唐芬芬等，2013a；覃玥等，2015）。本課題組通過對BmNPV多角體蛋白基因polh進行常規(guī)PCR擴增和測序分析，獲得了廣西多個毒株的polh基因序列信息（Liang et al.，2013），為LAMP的靶標選擇和引物設(shè)計打下了基礎(chǔ)。LAMP是一種操作簡單、反應(yīng)快速、高度特異和靈敏的核酸擴增技術(shù)（Nimitphak et al.，2000），自其問世以來，經(jīng)過不斷的優(yōu)化和改進，目前已廣泛應(yīng)用到不同領(lǐng)域的生物基因檢測及鑒別研究，如畜禽病原微生物L(fēng)AMP檢測方法的建立為生產(chǎn)現(xiàn)場的快速診斷提供了技術(shù)支持（Liu et al.，2011；彭宜等，2013；Pawar et al.，2014；Xie et al.，2014；鄧顯文等，2015；胡成等，2015；潘宏等，2015）?！颈狙芯壳腥朦c】目前生產(chǎn)上對家蠶血液型膿病的診斷主要依靠典型病征的肉眼觀察診斷，但BmNPV感染家蠶后的病程與家蠶齡期、病毒數(shù)量和毒力、飼養(yǎng)環(huán)境及家蠶體質(zhì)等因素有關(guān)，且該病為亞急性傳染病，可確診時期通常已發(fā)展到感病晚期，因此亟需建立一種特異、靈敏、快速、適合基層使用的可視化檢測技術(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立針對BmNPV的LAMP檢測技術(shù)，為生產(chǎn)開展家蠶血液型膿病早期診斷提供技術(shù)支持，及時發(fā)現(xiàn)病情并采取有效防治措施，控制該病的擴散傳播。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

BmNPV病毒、家蠶質(zhì)型多角體病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosisvirus，BmCPV）、家蠶微孢子蟲（Nosemabombycis，N.b）、靈菌敗血病菌（Serratia marcescens，S.m）、白僵病菌（Beauveria bassiana，B.b）由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蠶病研究室保存提供，DNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，ExTaq購自寶生物工程（大連）有限公司，Bst DNA聚合酶、甜菜堿（Betaine）、MgSO4、dNTPs、鈣黃綠素（Calcein）、MnCl2等購自榮研（中國）生物科技有限公司，羥基萘酚藍（HNB）購自上海源葉生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：分光光度計Thermo Scientific NANODROP 1000購自Scientific Thermo公司，LA-320C實時濁度儀購自日本Eiken Chemical公司。

1. 2 LAMP引物設(shè)計與合成

根據(jù)BmNPV標準參考毒株日本T3株（GenBank登錄號L33180.1）的polh基因序列，使用LAMP引物設(shè)計輔助軟件Primer Explorer V4進行在線設(shè)計。分別設(shè)計5組內(nèi)/外引物和5條環(huán)引物，再根據(jù)擴增效率篩選最佳引物組合。所有引物由廣州華大基因科技股份有限公司合成。

1. 3 DNA提取及陽性質(zhì)粒構(gòu)建

按本課題組建立的方法提取所有試材DNA，以分光光度計測定DNA濃度。采用常規(guī)PCR擴增BmNPV的polh基因完整ORF，將目的基因連接至pMD18-T載體，構(gòu)建陽性質(zhì)粒pMD18-polh，測序驗證模板的準確性（Liang et al.，2013）。

1. 4 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

將反應(yīng)溫度從60 ℃逐步提高至65 ℃，選擇最佳反應(yīng)溫度。確定反應(yīng)溫度后對反應(yīng)體系進行優(yōu)化，在不同濃度的反應(yīng)組分（2～12 mmol/L MgSO4、0.2～1.2 mol/L Betaine、0.6～1.6 mmol/L dNTPs）和不同反應(yīng)時間（20、40、60和80 min）條件下，在LA-320C實時濁度儀中進行LAMP反應(yīng)，每隔6 s測定1次濁度值。根據(jù)濁度值繪制濁度變化曲線，當(dāng)濁度值大于0.25即可判為陽性。

1. 5 環(huán)引物使用效果試驗

將陽性質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋（10-8～10-1），以此為模板分別進行兩組LAMP反應(yīng)，一組使用環(huán)引物，另一組不使用環(huán)引物，濁度儀實時測定反應(yīng)濁度的變化。

1. 6 LAMP特異性試驗

分別對BmNPV、BmCPV、N.b、S.m和B.b的DNA進行LAMP檢測，以健康家蠶的血細胞DNA為對照（CT），濁度儀實時測定反應(yīng)濁度的變化。

1. 7 LAMP敏感性試驗

將BmNPV基因組DNA進行10倍梯度稀釋（10-8～ 10-1），以此為模板分別進行LAMP和常規(guī)PCR檢測，濁度儀實時測定LAMP反應(yīng)的濁度值變化。常規(guī)PCR使用外引物F3/B3進行擴增，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1. 8 臨床樣本檢測試驗

分別采用LAMP和常規(guī)PCR對25份蠶病樣本的DNA進行檢測，比較兩種檢測方法的檢出率。LAMP反應(yīng)結(jié)果可視化判斷，即在反應(yīng)體系中加入120 μmol/L HNB，或加入20 μmol/L Calcein和0.5 mmol/L MnCl2，自然光下觀察染色結(jié)果。

1. 9 簡化樣本處理試驗

取1.6×108 OBs/mL的BmNPV多角體接種5齡起蠶，接種后第6 d采集感染家蠶的血淋巴，以等量超純水稀釋，分成兩組。一組添加多角體裂解緩沖液（0.2 mol/L Na2CO3+0.32 mol/L NaCl），另一組不添加多角體裂解緩沖液，然后分別對兩組樣品進行5種不同處理：①100 ℃煮沸10 min，使細胞破裂，蛋白變性；②加入1/10體積的10% SDS于55 ℃下作用1 h；③加入1/20體積的蛋白酶K于55 ℃下作用1 h；④加入1/10體積的10% SDS和1/20體積的蛋白酶K于55 ℃下作用1 h；⑤抽提DNA。12000 r/min離心10 min，各取2 μL上清液作為模板進行LAMP檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LAMP引物篩選及反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

以攜帶polh基因的陽性質(zhì)粒pMD18-polh為模板，分別使用5組LAMP引物的外引物進行常規(guī)PCR擴增預(yù)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均能擴增出目的片段。再使用5組內(nèi)/外引物在同等條件下進行LAMP檢測，結(jié)果顯示有4組內(nèi)/外引物能實現(xiàn)擴增反應(yīng)，根據(jù)濁度值變化曲線可看出，第3組引物擴增的濁度值變化速率最大，表現(xiàn)為陽性擴增反應(yīng)最快、反應(yīng)用時最短（圖1-A）。在選擇擴增效率最高的第3組內(nèi)/外引物基礎(chǔ)上，再分別使用5條環(huán)引物進行LAMP檢測，結(jié)果顯示，5條環(huán)引物均能使擴增效率進一步提高，其中以第2條環(huán)引物的提高效果最明顯，濁度值達陽性判定標準最快，與未使用環(huán)引物反應(yīng)相比，用時縮短近一半（圖1-B）。因此，選擇第3組內(nèi)/外引物和第2條環(huán)引物作為最佳的LAMP引物組合（表1）。對LAMP反應(yīng)條件進行優(yōu)化，確定最優(yōu)反應(yīng)體系為25.0 μL：F3和B3引物各5 pmol，F(xiàn)IP和BIP引物各40 pmol，LP引物20 pmol，0.6 mol/L Betaine，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA聚合酶，1.0 μL模板DNA；于63 ℃下恒溫反應(yīng)60 min，90 ℃滅活5 min。

2. 2 環(huán)引物使用效果比較結(jié)果

以10倍梯度稀釋的陽性質(zhì)粒為模板進行LAMP檢測，結(jié)果顯示，不使用環(huán)引物的LAMP反應(yīng)最低稀釋度為10-5，且在反應(yīng)開始約28 min時檢測到有polh基因的擴增（圖2-A）；使用環(huán)引物的LAMP反應(yīng)最低稀釋度為10-6，最低檢測限是不使用環(huán)引物的10倍，且在反應(yīng)開始約15 min時即檢測到有polh基因的擴增，較不使用環(huán)引物約提前1倍（圖2-B）。說明使用環(huán)引物不僅能使LAMP反應(yīng)時間縮短，還有利于提高其檢測敏感性。

2. 3 特異性試驗結(jié)果

由LAMP檢測的濁度變化曲線可知，BmCPV、N.b、S.m和B.b的LAMP檢測結(jié)果均呈陰性，對健康家蠶血細胞（CT）的DNA擴增也呈陰性，僅對BmNPV的DNA產(chǎn)生擴增反應(yīng)，且濁度快速達到陽性判斷標準，表明建立的LAMP檢測方法對靶標DNA擴增具有特異性。

2. 4 敏感性試驗結(jié)果

經(jīng)分光光度計測得基因組DNA濃度為70 ng/μL，進行10倍梯度稀釋后，以不同濃度的DNA稀釋液為模板分別進行LAMP和常規(guī)PCR檢測。濁度變化曲線（圖3-A）顯示，LAMP檢測的最低稀釋度為10-7，即最低DNA濃度為7 fg/μL。常規(guī)PCR檢測的最低稀釋度為10-5（圖3-B），即最低DNA濃度為700 fg/μL。LAMP的最低檢測限是常規(guī)PCR的100倍，表明LAMP檢測的敏感性高于常規(guī)PCR。

2. 5 臨床樣本檢測結(jié)果

陽性LAMP反應(yīng)過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂白色沉淀，因此反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液變混濁，靜置或低速離心反應(yīng)管，在管底可見白色沉淀。以HNB染色時，自然光下可見陽性反應(yīng)液呈淺藍色，陰性反應(yīng)液呈較深的藍紫色；采用鈣黃綠素和MnCl2染色時，陽性反應(yīng)液呈淺綠色，陰性反應(yīng)液呈淺橘色（圖4）。為了驗證LAMP檢測的穩(wěn)定性和實用性，分別采用LAMP和常規(guī)PCR對25份蠶病樣本的DNA進行檢測，比較兩種檢測方法的檢出率，結(jié)果表明，LAMP共檢測到21份BmNPV陽性樣本，常規(guī)PCR僅檢測出17份BmNPV陽性樣本。說明LAMP的檢出率高于常規(guī)PCR，尤其對于混合感染的樣本，微量的BmNPV DNA也能通過LAMP檢測出來。

2. 6 簡化樣本處理試驗結(jié)果

對BmNPV感染的家蠶血淋巴進行100 ℃煮沸10 min和抽提DNA處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加多角體裂解緩沖液與否均會出現(xiàn)陽性擴增反應(yīng)，但不添加多角體裂解緩沖液的處理在反應(yīng)開始約16 min即產(chǎn)生擴增（圖5-A），而添加多角體裂解緩沖液的處理在反應(yīng)開始44 min后才出現(xiàn)擴增（圖5-B）。抽提DNA的處理均在反應(yīng)開始12 min左右產(chǎn)生擴增；添加多角體裂解緩沖液的煮沸處理樣本，LAMP擴增反應(yīng)起始較慢，可能是由于強堿性裂解樣本改變了反應(yīng)體系的性質(zhì)，對Bst DNA聚合酶的活性產(chǎn)生影響；其他3種處理方式的LAMP檢測結(jié)果均為陰性，推測SDS和蛋白酶K對Bst DNA聚合酶造成了變性破壞，使其功能受損。

3 討論

LAMP內(nèi)/外引物可識別靶基因6個不同區(qū)域的核酸序列，其設(shè)計較常規(guī)PCR復(fù)雜，對特異性要求較高。Nagamine等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，在LAMP反應(yīng)中加入環(huán)引物能夠明顯加快擴增速度，縮短反應(yīng)時間，還能提高檢測的靈敏度。LAMP檢測的關(guān)鍵是靶標基因選擇與引物篩選。在線設(shè)計LAMP引物時會產(chǎn)生多組引物可供選擇，除了根據(jù)引物的Tm、GC含量、末端穩(wěn)定性等進行篩選外，反應(yīng)時間和效率也是決定引物優(yōu)劣的重要因素。在唐芬芬等（2013a）、覃玥等（2015）的BmNPV可視化LAMP方法建立研究中，都只設(shè)計1組LAMP引物進行試驗，未對LAMP引物進行篩選。本研究設(shè)計并合成了5組特異性的LAMP內(nèi)/外引物和5條環(huán)引物，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)有4組LAMP內(nèi)/外引物能實現(xiàn)擴增反應(yīng)，而5條環(huán)引物均能不同程度改善反應(yīng)效率，表明同一靶標基因的LAMP引物，結(jié)合位點不同，其反應(yīng)效率也存在差別，因此需根據(jù)反應(yīng)快慢和擴增速率篩選最佳引物組合。本研究通過濁度儀實時監(jiān)測反應(yīng)進程，能夠具體了解反應(yīng)起始快慢和擴增速率等信息，為引物篩選優(yōu)化提供了依據(jù)。此外，利用篩選的最佳引物組合，對常見家蠶病原微生物進行LAMP檢測，以排除交叉反應(yīng)的可能，結(jié)果顯示篩選出的最佳引物組合僅對靶標DNA的擴增具有特異性。

BmNPV的polh基因是病毒極晚期超量表達的結(jié)構(gòu)蛋白基因，編碼的多角體蛋白組裝形成多角體晶體結(jié)構(gòu)。Xu等（2013）通過對不同BmNPV毒株的基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)polh基因的保守性高于pe38基因。雖然與覃玥等（2015）的研究都選擇polh基因作為靶標基因，但本研究設(shè)計還使用了環(huán)引物，對BmNPV基因組DNA的最低檢測濃度為7 fg/μL，明顯低于覃玥等（2015）的研究結(jié)果（25 fg/μL），檢測敏感性得到改善。此外，使用環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時間比不使用環(huán)引物的縮短近一半，有效提高了反應(yīng)效率，且檢出率高于常規(guī)PCR。BmNPV對家蠶中腸細胞造成原發(fā)性感染后，產(chǎn)生的子代病毒即進入血腔侵染血細胞和其他易感組織細胞，受感染細胞崩解，細胞碎片被釋放進血腔，病毒隨之釋放到血液中。本研究將感染的血淋巴進行煮沸處理，使其中的血細胞和崩解組織細胞破裂，蛋白變性，病毒DNA暴露，離心后上清液可直接用于LAMP檢測，且擴增效率與抽提DNA的相近。該處理方法免除了DNA抽提步驟，更有利于生產(chǎn)現(xiàn)場的快速檢測。

LAMP檢測靈敏度高，但易受反應(yīng)產(chǎn)物形成的氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。本研究采用濁度儀實時監(jiān)測LAMP反應(yīng)，由于采用閉管擴增，可從源頭上控制氣溶膠污染。LAMP檢測結(jié)果可用肉眼觀察反應(yīng)液中的白色沉淀出現(xiàn)與否進行判斷（Mori et al.，2001），但有時會存在一定誤差。染色檢測法是通過添加染料指示劑使反應(yīng)液顏色差別明顯，易于目視判定反應(yīng)結(jié)果（Tomita et al.，2008；Goto et al.，2009）。Goto等（2009）研究表明，使用金屬離子染色劑HNB對LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進行染色，不但在自然光下易判斷結(jié)果，而且檢測靈敏度高于鈣黃綠素染色、接近SYBR GreenⅠ染色。本研究采用的HNB染色既能保證檢測的靈敏度，又能降低假陽性風(fēng)險，有效解決了LAMP檢測技術(shù)在生產(chǎn)現(xiàn)場的可視化使用問題。

本研究建立的BmNPV可視化LAMP檢測技術(shù)通過使用環(huán)引物改善了靈敏度，并縮短了反應(yīng)時間，對常見的家蠶病原微生物不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，且檢出率高于常規(guī)PCR，具有良好的特異性和實用性，采用HNB染色的結(jié)果易判定。此外，通過簡化樣本處理，使操作更便捷、成本更低，適合生產(chǎn)現(xiàn)場對BmNPV的快速檢測，為基層對家蠶血液型膿病的早期診斷和預(yù)防控制提供了技術(shù)支持。

4 結(jié)論

針對BmNPV建立的LAMP可視化檢測技術(shù)具有靈敏、快捷、可靠的特點，適合用于生產(chǎn)現(xiàn)場的BmNPV感染早期診斷，對及時發(fā)現(xiàn)病情并控制傳播范圍、減少病毒多角體在生產(chǎn)環(huán)境中富集、保障養(yǎng)蠶業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展具有積極作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）