應(yīng)用小鼠灌胃針和點(diǎn)樣吸頭建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法

楊彪+肖純凌

[摘要]目的 建立一套新型易操作的大、小鼠肺泡灌洗新方法。方法 依靠小鼠灌胃針和電泳點(diǎn)樣吸頭為工具，建立一套新型的大、小鼠肺泡灌洗操作系統(tǒng)。分別使用10 ml或1 ml的無(wú)菌注射器配合插管工具完成肺泡灌洗操作。研究中對(duì)10只雄性Wistar大鼠（體重220～250 g）和10只雄性CB17-SCID小鼠（體重24～28 g）進(jìn)行插管和肺泡灌洗液收集。結(jié)果 共完成20次大、小鼠的插管和肺泡灌洗操作，成功收集到1×107個(gè)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和3×106個(gè)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞。結(jié)論 應(yīng)用小鼠灌胃針和電泳點(diǎn)樣吸頭完成的收集大、小鼠肺泡灌洗液新方法，能夠被廣泛用于大、小鼠呼吸系統(tǒng)疾病模型的研究。

[關(guān)鍵詞]實(shí)驗(yàn)技術(shù)；小鼠灌胃器；電泳點(diǎn)樣吸頭；大鼠；小鼠

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）12（b）-0132-03

A new method of alveolar lavage in rat and mouse set up applying mouse stomach needle and point sample suction head

YANG Biao1 XIAO Chun-ling2

1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Key Lab of Environmental Pollution and Microecology，Shenyang Medical College in Liaoning Province，Shenyang 110034，China

[Abstract]Objective To develop a new method for easy rat and mouse alveolar lavage.Methods Mouse stomach needle and electrophoresis point sample suction head applied to develop a new alveolar lavage operation system in rat and mouse.Sterile syringe of 10 ml or 1 ml was used respectively to complete the alveolar lavage with the intubation tool.Ten male Wistar rats （weight was 220-250 g） and ten male CB17-SCID mice （weight was 24-28 g） were performed for intubation and alveolar lavage fluid collection.Results 20 times of intubation and alveolar lavage operation were completed.1×107 alveolar macrophages from rat and 3×106 alveolar macrophages from mouse were successfully collected.Conclusion A new method of alveolar lavage in rat and mouse set up applying mouse stomach needle and point sample suction head can be widely used in the study of respiratory disease model in rat and mouse.

隨著呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病研究的深入，利用肺泡灌洗液中成分的變化及其在疾病中的意義，對(duì)研究各種因素所引發(fā)的肺相關(guān)疾病具有重要價(jià)值[1-2]。很多實(shí)驗(yàn)室對(duì)大、小鼠肺泡灌洗方法不斷的進(jìn)行革新[3-9]，隨之而來(lái)的許多成功有效的技術(shù)手段得到廣泛的應(yīng)用。為了本課題組開展進(jìn)一步科學(xué)研究的需要，本研究建立了應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)器材建立大、小鼠肺泡灌洗的新方法，這種方法的應(yīng)用和推廣將從經(jīng)濟(jì)層面和技術(shù)層面幫助到更多實(shí)驗(yàn)室的科研人員。本研究簡(jiǎn)要描述具體的操作方法和要點(diǎn)，期待與廣大研究者進(jìn)行探討和學(xué)習(xí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物：10只Wistar大鼠[體重220～250 g，許可證號(hào)：SCXK （京） 2012-0001]和10只雄性CB17-SCID小鼠[體重24～28 g，許可證號(hào)：SCXK （京） 2012-0001]購(gòu)于北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，12 h/12 h晝夜光照，動(dòng)物房溫度為22～24℃，濕度為70%。

材料：乙醚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、小鼠灌胃針（12#，6 cm）、1～200 μl Pipette Tip （Thermo Fisher，Cat.# 010-Q）、PBS（Ca2+，Mg2+ Free，Hyclone，GE）、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、1#手術(shù)線、Leica AM6000顯微鏡、1640培養(yǎng)基、四季青胎牛血清及1 ml和10 ml無(wú)菌注射器（鎮(zhèn)江康利醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 操作方法

1.2.1 大鼠肺泡灌洗操作方法 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：首先對(duì)小鼠灌胃針等器具進(jìn)行滅菌。在50 ml離心管底部填充約5 ml體積的棉球，然后用吸管向棉球內(nèi)部添加3 ml乙醚液體，如果需要增加大鼠麻醉數(shù)量，適時(shí)補(bǔ)充乙醚的使用劑量。對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行麻醉處理，觀察大鼠的呼吸頻率，待呼吸由急促轉(zhuǎn)慢時(shí)，將其固定于鼠板上，此時(shí)如果大鼠蘇醒，重復(fù)進(jìn)行麻醉。將大鼠處死（大鼠腹主動(dòng)脈法采血），然后噴灑適量75%乙醇，在無(wú)菌條件下進(jìn)行支氣管肺泡灌洗術(shù)。

肺泡灌洗操作：①沿正中線剪開腹部和頸部皮膚，分離大鼠肺和氣管組織。將氣管和肺組織置于直徑100 mm培養(yǎng)皿中，先將1#手術(shù)線打結(jié)放在距離氣管切口端5 mm左右位置，然后將經(jīng)過(guò)滅菌處理的小鼠灌胃針插入到大鼠氣管中，同時(shí)用力系緊之前在近氣管切口端的打結(jié)（圖1）。取注射器抽取預(yù)冷的不含鈣鎂離子的PBS緩沖液5 ml注入肺腔，輕輕按摩肺臟，停留20 s后再緩慢回抽支氣管肺泡灌洗液。以上操作重復(fù)10次，25～40 ml液體。② 置于4℃離心機(jī)以1000 r/min，離心10 min，后棄上清液。③ 10%小牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，貼壁生長(zhǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 小鼠肺泡灌洗操作方法 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：首先進(jìn)行插管器具處理，即用剪刀減掉吸頭末端約5 mm，在實(shí)驗(yàn)操作之前完成Thermo吸頭與1 ml注射器的吻合要求，注意一定要吻合良好（如果剪刀剪去的長(zhǎng)度不合適，會(huì)使吸頭與注射器的吻合性差，灌洗時(shí)發(fā)生漏液）。處理好吸頭后，與其他實(shí)驗(yàn)器具一并滅菌。CB17-SCID鼠處死（小鼠摘眼球法采集外周血），固定鼠板后噴灑適量75%乙醇，在無(wú)菌條件下進(jìn)行支氣管肺泡灌洗術(shù)。

肺泡灌洗操作：①沿正中線剪開腹部和頸部皮膚，分離小鼠肺和氣管組織。將氣管和肺組織置于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，先將1#手術(shù)線打結(jié)放在在氣管切口端5 mm左右位置，然后將經(jīng)過(guò)剪切及滅菌處理的吸頭插入到小鼠氣管中，同時(shí)用力系緊之前在近氣管切口端的打結(jié)（圖2）。取注射器抽取預(yù)冷的不含鈣鎂離子的PBS緩沖液1 ml注入肺腔，輕輕按摩肺臟，停留20 s后再緩慢回抽支氣管肺泡灌洗液。以上操作重復(fù)10次，5～8 ml液體。②置于4℃離心機(jī)以1000 r/min，離心10 min，后棄上清液。③10%小牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，貼壁生長(zhǎng)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。

2結(jié)果

依靠小鼠灌胃針和電泳點(diǎn)樣吸頭建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法共完成20次插管和肺泡灌洗操作，收集的肺泡巨噬細(xì)胞，用10%小牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)可以得到約1×107個(gè)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)特征如圖3所示； 經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)可以得到約3×106個(gè)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞，形態(tài)特征如圖4所示。經(jīng)過(guò)貼壁選擇及圖像采集證明獲得的細(xì)胞為高質(zhì)量的肺泡巨噬細(xì)胞，提示實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法有效，創(chuàng)新收集肺泡灌洗液的方法成功。

3討論

近年呼吸系統(tǒng)疾病的研究呈上升趨勢(shì)，支氣管肺泡灌洗技術(shù)已越來(lái)越多地應(yīng)用于外源性化合物對(duì)肺臟毒性作用的研究，通過(guò)對(duì)支氣管肺泡灌洗液（ bronchalveolar lavage fluid， BALF）中細(xì)胞、生化、肺表面活性物質(zhì)等多種成分的分析，可以探討化合物對(duì)肺臟的作用機(jī)制[10-12]。BALF中一些酶類的變化可以直接反映肺組織細(xì)胞的氧化損傷情況。獲取的肺泡巨噬細(xì)胞直接暴露于引發(fā)呼吸系統(tǒng)炎性疾病的各種因子中，而這些成分激活的肺泡巨噬細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子并激活其他效應(yīng)細(xì)胞，甚至破壞肺部組織結(jié)構(gòu)[13-14，2]。應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法已經(jīng)成為呼吸系統(tǒng)損傷機(jī)制研究的必要技術(shù)。

應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①將氣管和肺組織剪切下來(lái)，可視性更好，可以更加直觀地完成灌洗操作；②應(yīng)用小鼠灌胃針完成大鼠肺泡灌洗操作，首先，可以更好地避免實(shí)驗(yàn)器具給組織帶來(lái)的損傷，另外，還可以防止結(jié)扎后組織和灌胃針脫離的發(fā)生；③應(yīng)用處理后于1 ml注射器相吻合的點(diǎn)樣吸頭，由于吸頭一端到另一端逐漸變細(xì)，所以可以與小鼠氣管接觸得更緊密，防止漏液的發(fā)生，同時(shí)也可以避免使用金屬銳器完成灌洗造成的組織破壞。

操作的注意事項(xiàng)：①灌洗前采集血樣時(shí)，大鼠腹主動(dòng)脈采血量應(yīng)>6 ml；小鼠摘眼球采血量應(yīng)>0.5 ml；如果采集的血量太少，則需要加入適量的紅細(xì)胞裂解液，消除紅細(xì)胞對(duì)研究帶來(lái)的影響；按照上述要求完成的肺泡灌洗液收集的細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)更換培養(yǎng)基，即可以除去未貼壁生長(zhǎng)的紅細(xì)胞。②分離大、小鼠氣管和肺組織時(shí)，切勿剪破肺組織，造成灌洗操作無(wú)法完成，而且小鼠氣管的剪切要盡量靠近其口咽部，保證氣管長(zhǎng)度足夠通過(guò)吸頭完成肺泡灌洗液的收集。③進(jìn)行灌洗時(shí)，注意灌胃針和吸頭的推進(jìn)角度及注射器推入液體的速度，推進(jìn)角度太大容易造成氣管組織破損，液體推入的速度太快容易漏液。④抽取灌洗液時(shí)，要由氣管一端到另一端變換位置完成，一般來(lái)說(shuō)，可以由近支氣管端向遠(yuǎn)端進(jìn)行，因?yàn)闅夤苡?/3左右的纖維結(jié)締組織的特殊組織結(jié)構(gòu)，所以抽取液體時(shí)結(jié)締組織會(huì)阻塞吸頭，需要變更位置完成。⑤進(jìn)行肺泡灌洗操作時(shí)，要逐一完成，如同時(shí)收集多組氣管和肺組織，可由多人完成肺泡灌洗液操作，否則會(huì)影響獲得肺泡巨噬細(xì)胞的質(zhì)量。

綜上所述，通過(guò)小鼠灌胃針和電泳點(diǎn)樣吸頭建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法，大膽地改進(jìn)和創(chuàng)新了肺泡灌洗方法的實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室耗材建立的大、小鼠肺泡灌洗新方法操作簡(jiǎn)潔，可重復(fù)性好，能夠廣泛用于大、小鼠肺泡灌洗液的收集。熟練此種技術(shù)可以更好地為科學(xué)研究服務(wù)。

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