盛悅，何音華，沈月，李雪，王旭東，蔡丹

猴頭菌液體固體發(fā)酵產(chǎn)物多糖抗氧化活性研究

盛悅，何音華，沈月，李雪，王旭東，*蔡丹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

通過還原能力的測定和DPPH·，O2-·，·OH清除率的測定，體外抗氧化試驗結(jié)果表明，猴頭菌多糖具有較強的抗氧化活性，在試驗的3種多糖中，抗氧化能力依次為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物多糖HeP3＞液體發(fā)酵菌絲體多糖HeP1＞發(fā)酵液多糖HeP2。

猴頭菌；多糖；提??；抗氧化活性

0 引言

猴頭菌（Hericiumerinaceus），是一種著名的食藥兼用真菌[1-2]，其發(fā)酵產(chǎn)物中的有效成分多糖物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于研究腫瘤、治療胃炎及消化道潰瘍等疾病，目前已經(jīng)有臨床運用的實例[3-5]。相關(guān)研究證明，猴頭菌所含的多糖物質(zhì)不僅有抗氧化抗衰老[6-7]、降血糖血脂[8-9]、抗腫瘤[10]的功能，還有免疫調(diào)節(jié)[11-14]等生物活性。相關(guān)學(xué)者對此做了大量的研究來幫助分析猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物中的某些化學(xué)成分和對應(yīng)的功能活性之間的關(guān)聯(lián)[3-5，15-22]，其中有關(guān)于多糖物質(zhì)在抗氧化性的研究報道較少。相關(guān)課題組多年來一直致力于大型真菌改性玉米醇溶蛋白的系統(tǒng)研究，前期研究成果表明，以玉米醇溶蛋白為主要成分進行發(fā)酵，其產(chǎn)物中多糖產(chǎn)量較高，并具有一定的生理活性。因此，試驗以前期研究成果為基礎(chǔ)，開展以猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物為原料進行多糖的提取及體外抗氧化試驗測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

猴頭菌菌種，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥和玉米深加工國家工程實驗室提供。

1.1.2 菌種保存斜面培養(yǎng)基

固體PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

玉米蛋白粉，吉林中糧生化能源銷售有限公司提供；玉米粉、馬鈴薯，市售；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、白砂糖、葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉，以及MgSO4，KH2PO4均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；LD5-2B型離心機，北京雷勃爾離心機有限公司產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菌的活化

將4℃貯藏的猴頭菌菌種轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中于27℃下培養(yǎng)至第12天時采用。

1.3.2 種子培養(yǎng)基的制備

可溶性淀粉2%，葡萄糖3%，酵母浸粉1%，七水合硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.3%，自然pH值，121℃下滅菌20min。

1.3.3 液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

玉米蛋白粉12%，葡萄糖3.5%，磷酸二氫鉀0.35%，VB10.0015%，于121℃下滅菌20min。接種量10%，培養(yǎng)溫度25℃，初始pH值5.5，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。

1.3.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

玉米蛋白粉30g，葡萄糖4%，碳酸鈣0.75%，料液比1∶1.25，于121℃下滅菌20min。接種量16%，pH值5.5，培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間15d。1.3.5粗多糖樣品的制備

猴頭菌液體發(fā)酵培養(yǎng)6d后，用布氏漏斗分離發(fā)酵產(chǎn)物，分別獲得菌絲體和發(fā)酵液。①將發(fā)酵液置于圓底燒瓶中，于60℃條件下減壓濃縮，加入預(yù)冷的95%乙醇溶液達到終質(zhì)量分數(shù)80%，調(diào)節(jié)pH值為6，于4℃條件下醇沉12h，然后離心收集沉淀，用75%的乙醇清洗沉淀，直至無還原糖反應(yīng)，再按照無水乙醇、丙酮、乙醚的順序進行清洗，水浴溶解，以轉(zhuǎn)速4500r/min離心10min后得上清液。②采用Sevag法[23]脫去蛋白，加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），漩渦混勻器快速振蕩20min后靜置10min，以轉(zhuǎn)速4500r/min離心15min，除去含蛋白的部分，重復(fù)多次，直至用考馬斯亮藍法檢測無蛋白。③加入2%的活性炭，水浴溫度60℃，水浴時間30min，不斷攪拌進行脫色，然后過濾得到粗多糖，儲存?zhèn)溆?。④用蒸餾水沖洗過濾得到的菌絲體，直至無發(fā)酵液殘留，然后于60℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎過60目篩，取5g樣品，超聲功率600W，超聲時間30min，超聲溫度80℃，料液比1∶35，提取3次，醇沉及其他操作同上。⑤猴頭菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)15d后，在60℃的條件下烘干至恒質(zhì)量，粉碎過60目篩，取5g樣品，超聲功率600W，超聲時間30min，超聲溫度80℃，料液比1∶30，提取3次，醇沉及其他操作同上。

1.3.6 純化

將制備粗多糖樣品溶于蒸餾水中，置于透析袋（8000～10000Da）中，自來水流動透析48h，然后用蒸餾水透析48h（每隔6h換1次蒸餾水）；減壓濃縮，真空冷凍干燥得精制多糖，備用；精制多糖分別經(jīng)DEAE-52型纖維素離子交換柱（1cm×20cm）層析和SephadexG-75型凝膠柱（2.5cm×50cm）層析后，進行體外抗氧化活性測定。

1.3.7 還原能力的測定

試驗利用了普魯士藍法[24-25]，以抗壞血酸為陽性對照，對猴頭菌的發(fā)酵產(chǎn)物中多糖還原能力進行分析。

計算公式為：

式中：A——樣品OD值；

A0——空白OD值。

1.3.8 DPPH·清除率的測定

采用改良的DPPH分析法，以抗壞血酸為陽性對照，測定了猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物中多糖的抗氧化活性。

計算公式為：

式中：A0——空白組OD值；

A——樣品OD值；

A1——對照組OD值。

試驗過程中采用改良的鄰苯三酚法，進行猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物中多糖的抗氧化活性測定，以抗壞血酸為陽性對照。

計算公式為：

式中：A0——空白組OD值；

A——樣品OD值；

A1——對照組OD值。

1.3.10 ·OH清除率的測定

試驗以Fenton法為基礎(chǔ)加以改良，進行猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物中多糖的抗氧化活性測定，以抗壞血酸為陽性對照。

計算公式為：

式中：Ac——空白組OD值；

Ai——樣品OD值；

Aj——對照組OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖總還原能力測定

機體內(nèi)部的Fe2+可催化脂質(zhì)過氧化，從而引起多種疾病，并具有較高的反應(yīng)活性，故對金屬離子Fe2+的鰲合能力被用于評價抗氧化劑清除自由基的重要指標(biāo)之一。其中，HeP1是液體發(fā)酵菌絲體多糖，HeP2是發(fā)酵液多糖，HeP3是固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物多糖。

猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖和VC的還原能力見圖1。

圖1 猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖和VC的還原能力

由于吸光度越大，還原力越強，抗氧化能力越好。由圖1可知，各樣品的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強。其中，HeP1低質(zhì)量濃度時增長速度很快，而HeP3前期增長速度較慢；當(dāng)質(zhì)量濃度達到5mg/mL時，還原能力高于HeP1，但仍低于VC的還原能力。

2.2 猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖DPPH·清除能力

DPPH·是一種比較穩(wěn)定的自由基，已廣泛用于評估抗氧化劑清除自由基活性中。

猴頭菌He-02發(fā)酵產(chǎn)物多糖和VC對DPPH·的清除能力見圖2。

圖2 猴頭菌He-02發(fā)酵產(chǎn)物多糖和VC對DPPH·的清除能力

由圖2可知，隨著試驗樣品質(zhì)量濃度的增大，各樣品對DPPH·的清除能力隨之逐漸增強，當(dāng)質(zhì)量濃度為5mg/mL時，HeP3清除能力最強，HeP2的清除能力相對較弱；且當(dāng)質(zhì)量濃度逐漸增大，HeP3與VC的抗氧化性逐漸靠近。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為5mg/mL時，3種多糖樣品對DPPH·的清除能力按次序為59.33%，48.47%，66.14%。

圖3 猴頭菌He-02發(fā)酵產(chǎn)物多糖和VC對O2-·的清除能力

2.4 猴頭菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖·OH清除能力

·OH在眾多自由基中反應(yīng)活性最強，它可引起周圍生物大分子的嚴重損傷，進而引起機體衰老等。因此，·OH清除率是評價抗氧化作用的重要指標(biāo)。

猴頭菌He-02發(fā)酵產(chǎn)物多糖和VC對·OH的清除能力見圖4。

圖4 猴頭菌He-02發(fā)酵產(chǎn)物多糖和VC對·OH的清除能力

·OH被公認為活性最強的自由基，也是評價抗氧化活性的重要指標(biāo)之一。由圖4可知，HeP3對于·OH的清除能力最強，HeP2對·OH的清除能力最弱。

3 結(jié)論

體外抗氧化試驗結(jié)果表明，猴頭菌多糖具有較強的抗氧化活性，在試驗的3種多糖中，抗氧化能力依次為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物多糖HeP3＞液體發(fā)酵菌絲體多糖HeP1＞發(fā)酵液多糖HeP2。試驗中，固體發(fā)酵產(chǎn)物多糖抗氧化活性略優(yōu)于液體發(fā)酵，可能是由于不同發(fā)酵形式的培養(yǎng)基含水量不同，而含水量影響菌種的生理代謝過程，進而影響多糖組成，從而影響多糖的抗氧化活性。

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StudyonAntioxidantActivityofPolysaccharidefromHericiumerinaceusLiquid andSolidFermentationProducts

SHENGYue，HEYinhua，SHENYue，LIXue，WANGXudong，*CAIDan
（NationalEngineeringLaboratoryforDeepProcessingofWheatandCorn，CollegeofFoodScienceandEngineering，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin130118，China）

Throughdeterminationsofreducingcapacity，DPPH·freeradicalscavengingrate，·scavengingrate，and·OH scavengingrate，thein-vitroantioxidanttestresultshaveshownthatthefermentationbrothpolysaccharideofHericium erinaceushasastrongabilityofscavengingthefreeradical.Amongthethreekindsofpolysaccharidesinthisexperiment，the antioxidantcapacityofHeP3＞HeP1＞HeP2.

Hericiumerinaceus；polysaccharide；exaction；antioxidantactivity

S646

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.031

1671-9646（2017）04b-0009-04

2017-03-01

吉林省科技發(fā)展計劃（20140204011NY）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS02-29）。

盛悅（1992—），女，在讀碩士，研究方向為食品生物化學(xué)工程與功能性食品。

*通訊作者：蔡丹（1980—），女，博士，副教授，研究方向為乳品科學(xué)與發(fā)酵工程。