‘紅香芋’莖尖玻璃化法保存條件的篩選

臧玉文， 蔣芳玲， 劉 敏， 程雅琪， 孔祥宇， 吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 農(nóng)業(yè)部南方蔬菜遺傳改良重點開放實驗室， 江蘇 南京 210095)

‘紅香芋’莖尖玻璃化法保存條件的篩選

臧玉文， 蔣芳玲， 劉 敏， 程雅琪， 孔祥宇， 吳 震①

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 農(nóng)業(yè)部南方蔬菜遺傳改良重點開放實驗室， 江蘇 南京 210095)

芋〔Colocasiaesculenta(Linn.) Schott〕通常用球莖繁殖，其種質(zhì)保存方式主要為建立種質(zhì)圃，但具有占用空間大、投入較高、易遭受脅迫等問題[1]。超低溫保存技術(shù)具有穩(wěn)定、經(jīng)濟、有效等優(yōu)點，適合無性繁殖和非正常性種子繁殖植物的種質(zhì)保存[2]，而玻璃化法作為一種更優(yōu)的保存技術(shù)已成功應(yīng)用于多種植物的種質(zhì)保存[3-4]。目前，芋的玻璃化冷凍保存主要以愈傷組織或體胚為材料[5]，但再生培養(yǎng)時易發(fā)生變異，而利用莖尖或分生組織則能避免此類情況的發(fā)生[6]。

作者以芋品種‘紅香芋’(‘Hongxiangyu’)試管苗莖尖為材料，研究了預(yù)培養(yǎng)、玻璃化保護液裝載與脫水、化凍等過程對其凍存效果的影響，以確定適宜的玻璃化法超低溫保存技術(shù)，為建立更加簡單可靠的芋種質(zhì)資源保存體系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試芋品種‘紅香芋’為江蘇省金壇市優(yōu)良地方品種，現(xiàn)保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院。選擇頂芽飽滿、未感病的球莖，割取頂芽、剝?nèi)ネ鈱喻[片，消毒后備用。

1.2 方法

1.2.1 莖尖繼代培養(yǎng) 將供試頂芽置于MS培養(yǎng)基(含1.0 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、30 g·L-1蔗糖和6.5 g·L-1瓊脂)中繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照度3 000～4 000 lx、光照時間12 h·d-1、溫度(25±1) ℃。

1.2.2 蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時間篩選 剝?nèi)o菌苗1 cm莖尖，分別接種在含0.2、0.4、0.6和0.8 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基上，按照上述培養(yǎng)條件分別預(yù)培養(yǎng)0、1、2、3和4 d。預(yù)培養(yǎng)后的莖尖經(jīng)過60% PVS2(PVS2由體積分?jǐn)?shù)30%甘油、體積分?jǐn)?shù)15%乙二醇、體積分?jǐn)?shù)15%DMSO以及含0.4 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)液組成)裝載30 min，PVS2脫水15 min；將莖尖放入裝有新鮮PVS2的凍存管中，于液氮中保存；24 h后取出凍存管，40 ℃水浴解凍1 min；用含1.2 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)液洗2次，各10 min，然后用TTC法[7]檢測莖尖存活率。

1.2.3 裝載與脫水條件篩選 將莖尖接種在含0.6 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3 d，然后按照CK(對照)組以及T1、T2、T3和T4處理組的設(shè)置分別裝載與脫水。對照組直接置于液氮中保存24 h；T1、T2和T3處理組分別先用60%PVS2裝載10、20和30 min，再用PVS2脫水15 min；T4處理組依次用PVS2處理20和15 min。從對照組和各處理組分別取出一批莖尖，用濾紙吸去表面水分，稱量鮮質(zhì)量；然后于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量，計算莖尖含水量。其余莖尖進行凍存和化凍后測定莖尖存活率。

1.2.4 化凍條件篩選 將莖尖接種在含0.6 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3 d，經(jīng)過60%PVS2裝載30 min，PVS2脫水15 min，放入凍存管，液氮保存24 h；然后，分別置于30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃的水浴中化凍，化凍時間分別為1和2 min，按照上述方法分別測定莖尖存活率。

1.2.5 莖尖再生培養(yǎng) 以上述篩選的最優(yōu)條件凍存的莖尖為實驗材料進行再生培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含0.5 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、0.09 mol·L-1蔗糖和6.5 g·L-1瓊脂的MS培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)35 d[8]，培養(yǎng)條件同上。觀察植株生長狀況并統(tǒng)計成苗數(shù)，計算再生率。

上述各處理使用的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液pH值均為6.8，以21個莖尖為1個重復(fù)，各處理均設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計分析

按照公式“含水量=〔(莖尖鮮質(zhì)量-莖尖干質(zhì)量)/莖尖鮮質(zhì)量〕×100%”、“存活率=(完全顯深紅色的莖尖數(shù)/經(jīng)TTC處理的莖尖總數(shù))×100%”和“再生率=(再生成苗的莖尖數(shù)/凍存莖尖總數(shù))×100%” 分別計算莖尖的含水量、存活率和再生率。

采用EXCEL 2003和SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時間對莖尖存活率的影響

不同蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時間對凍存后‘紅香芋’莖尖存活率的影響見表1。結(jié)果顯示：蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時間均對莖尖存活率有明顯促進作用。在蔗糖濃度0.2和0.4 mol·L-1的條件下莖尖存活率隨預(yù)培養(yǎng)時間延長而逐漸增大；而在蔗糖濃度0.6和0.8 mol·L-1的條件下莖尖存活率先升高后下降，分別在第3天和第2天達最高。預(yù)培養(yǎng)第0天和第4天，各處理組的莖尖存活率均無顯著差異；預(yù)培養(yǎng)第1天至第3天，蔗糖濃度0.6和0.8 mol·L-1處理組的莖尖存活率總體上顯著高于其他2個處理組；總體上看，中蔗糖濃度提高而增大。

莖尖存活率隨培養(yǎng)基

表1 蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時間對凍存后‘紅香芋’莖尖存活率的影響1)

Table 1 Effects of sucrose concentration and pre-culture time on survival rate of shoot tip ofColocasiaesculenta‘Hongxiangyu’ after cryopreservation1)

蔗糖濃度/mol·L-1Conc.ofsucrose預(yù)培養(yǎng)不同時間后莖尖的存活率/% Survivalrateofshoottipafterpre-culturedfordifferenttimes0d1d2d3d4d0.26.35±2.75a12.70±2.75b17.46±2.75b26.98±5.50c39.69±4.76a0.46.35±2.75a15.88±2.75b25.40±2.75b36.51±2.75bc42.86±4.76a0.66.35±2.75a20.64±2.75b41.27±9.91a55.56±7.27a46.03±5.50a0.86.35±2.75a34.92±2.75a46.03±7.27a44.44±7.27ab41.27±2.75a

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2.2 玻璃化裝載與脫水對莖尖含水量和存活率的影響

玻璃化裝載和脫水方式對‘紅香芋’莖尖含水量和存活率的影響見圖1。結(jié)果顯示：各處理組的莖尖含水量均顯著低于對照組，T4處理組的莖尖含水量最低(為31.57%)，T1、T2和T3處理組間無顯著差異。對照組的莖尖存活率為0%，而T3處理組的莖尖存活率最高(達65.08%)，顯著高于T1、T2和T4處理組；總體上看，莖尖存活率隨裝載時間延長而增大。綜合分析結(jié)果顯示：經(jīng)60%PVS2裝載30 min，再經(jīng)PVS2脫水15 min，莖尖的含水量適宜、存活率最高。

2.3 化凍溫度和時間對莖尖存活率的影響

化凍溫度和時間對‘紅香芋’莖尖存活率的影響見圖2。結(jié)果顯示：在化凍溫度30 ℃～60 ℃條件下，莖尖均能快速解凍，且相同化凍溫度下化凍時間對莖尖存活率無明顯影響；而在化凍時間相同的情況下，化凍溫度為40 ℃～60 ℃，莖尖存活率總體上無顯著差異。故莖尖經(jīng)液氮保存后，在1～2 min內(nèi)于40 ℃～60 ℃快速化凍即可。

□： 含水量 Water content； ■： 存活率 Survival rate.CK： 對照 The control； T1， T2， T3： 60%PVS2分別裝載10、20和30 min， PVS2脫水15 min Loaded for 10， 20 and 30 min by 60% PVS2， respectively， then dehydrated for 15 min by PVS2； T4： 用PVS2依次處理20和15 min Treated for 20 and 15 min orderly by PVS2. 同一指標(biāo)的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases of the same index indicate the significant difference (P<0.05).圖1 玻璃化保護液裝載和脫水方式對‘紅香芋’莖尖含水量和存活率的影響Fig. 1 Effects of vitrification protection liquid loaded and dehydrated measures on water content and survival rate of shoot tip of Colocasia esculenta ‘Hongxiangyu’

□： 化凍1 min Thawing for 1 min； ■： 化凍2 min Thawing for 2 min.不同的小寫字母表示同一化凍時間不同化凍溫度間差異顯著(P<0.05) Different lowercases indicate the significant difference in the same thawing time among different thawing temperatures (P<0.05).圖2 化凍溫度和時間對‘紅香芋’莖尖存活率的影響Fig. 2 Effects of thawing temperature and time on survival rate of shoot tip of Colocasia esculenta ‘Hongxiangyu’

2.4 莖尖再生植株的生長狀況觀察

‘紅香芋’莖尖經(jīng)玻璃化法超低溫保存后接種于再生培養(yǎng)基上，其生長狀況見圖3。結(jié)果表明：化凍后的莖尖接種在再生培養(yǎng)基中均能夠恢復(fù)生長，暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)10 d后莖尖萌動長出幼芽，光下培養(yǎng)約35 d后莖尖再生成幼小植株(圖3-A)，再生率為39.68%。與正常莖尖的試管苗(圖3-B)相比，兩者在形態(tài)上沒有明顯差異。

A： 培養(yǎng)約50 d玻璃化莖尖形成的試管苗Plantlet from vitrified shoot tips after cultured for about 50 d； B： 正常莖尖形成的試管苗Plantlet from normal shoot tip.圖3 ‘紅香芋’玻璃化莖尖與正常莖尖的再生狀況比較Fig. 3 Comparison on regeneration status between vitrified shoot tip and normal shoot tip of Colocasia esculenta ‘Hongxiangyu’

3 討論和結(jié)論

影響植物離體莖尖玻璃化法超低溫保存效果的因素有很多，包括預(yù)培養(yǎng)方式、玻璃化保護液裝載和脫水方式及化凍條件等。香石竹(DianthuscaryophyllusLinn.)在含0.5 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1 d后凍存的莖尖存活率最高[9]，本研究結(jié)果與其有一定差異。說明利用此技術(shù)保存不同植物種質(zhì)時，須篩選各自適宜的蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時間。

本研究中，脫水前先用60%PVS2處理30 min，莖尖存活率大于直接利用PVS2脫水處理，可能由于低濃度保護液可緩解劇烈脫水對細(xì)胞的傷害，也說明直接用高濃度玻璃化溶液脫水，可使細(xì)胞滲透壓劇烈變化，導(dǎo)致細(xì)胞損害[10]。本研究中，用60%PVS2裝載10～30 min，莖尖含水量無差異，但處理30 min莖尖存活率最高，是因為用玻璃化保護液處理莖尖，不僅要降低含水量，還須使保護劑充分浸入細(xì)胞以提高莖尖抗凍性，裝載時間過短則無法有效抗凍。

化凍條件對存活率影響較大?！t香芋’莖尖適宜的化凍條件為在40 ℃水浴中快速處理1～2 min；當(dāng)溫度升至60 ℃時，莖尖存活率無顯著差異。由于用較高溫度化凍不易掌握且重復(fù)性差，并易出現(xiàn)化學(xué)毒性傷害[8]，因此，40 ℃是‘紅香芋’莖尖最合適的化凍溫度。

綜上所述，適宜于‘紅香芋’莖尖玻璃化超低溫保存的步驟為：莖尖先用含0.6 mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3 d，然后用60%PVS2裝載30 min，再經(jīng)PVS2脫水15 min，將莖尖置于液氮中冷凍保存。經(jīng)過超低溫保存的莖尖在40 ℃水浴中化凍1～2 min，經(jīng)過再生培養(yǎng)，即可獲得正常試管苗。

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(責(zé)任編輯： 郭嚴(yán)冬)

Screening on vitrification conservation conditions for shoot tip ofColocasiaesculenta‘Hongxiangyu’

ZANG Yuwen， JIANG Fangling， LIU Min， CHENG Yaqi， KONG Xiangyu， WU Zhen①

(Key Laboratory of Southern Vegetable Crop Genetic Improvement of Ministry of Agriculture， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China)，

J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(1)： 116-118

In order to screen suitable vitrification conservation conditions for shoot tip ofColocasiaesculenta‘Hongxiangyu’， pre-culture， vitrification protection and thawing conditions were compared. The results show that with increasing of sucrose concentration in the medium and extending of pre-culture time， survival rate of shoot tip increases gradually. After different loaded and dehydrated measures, water content in shoot tip is lower than that of the control， while survival rate of shoot tip increases significantly than that of the control. Thawing for 1-2 min at 40 ℃-60 ℃ generally has no significant effect on survival rate of shoot tip. Suitable cryopreservation steps of vitrification as follows： shoot tip pre-cultured for 3 d in medium with 0.6 mol·L-1sucrose firstly， then loaded for 30 min in 60% PVS2， dehydrated for 15 min in PVS2， put in PVS2 and conserved in liquid nitrogen, and shoot tip thawed for 1-2 min in 40 ℃.

紅香芋； 莖尖； 玻璃化保存； 存活率

Colocasiaesculenta‘Hongxiangyu’； shoot tip； vitrification conservation； survival rate

2016-05-23

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)

臧玉文(1989—)，女，河北保定人，碩士研究生，主要從事蔬菜生理生態(tài)方面的研究。

①通信作者E-mail： zpzx@njau.edu.cn

Q943.1； S632.3

A

1674-7895(2017)01-0116-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.01.18