前后盤吸蟲梅花鹿源分離株的種類鑒定及遺傳進化分析

簡永利，涂宜強，高永安，宋軍科

(1.溫州科技職業(yè)學院，浙江溫州 325006; 2. 西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

前后盤吸蟲梅花鹿源分離株的種類鑒定及遺傳進化分析

簡永利1，涂宜強1，高永安1，宋軍科2

(1.溫州科技職業(yè)學院，浙江溫州 325006; 2. 西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

旨在研究溫州地區(qū)的梅花鹿源前后盤吸蟲的種類和遺傳進化，利用形態(tài)學和分子生物學方法，對蟲體樣本進行染色顯微鏡觀察及 pcox1和 pnad1序列的PCR擴增和序列分析。形態(tài)學鑒定結果表明，前后盤吸蟲梅花鹿源分離株在外部形態(tài)、大小以及內部組織器官與鹿前后盤吸蟲(Paramphistomumcervi)相近。序列比較分析結果表明，3株前后盤吸蟲梅花鹿源分離株樣本的 pcox1和 pnad1序列完全一致，擴增產物長度分別為446和505 bp，與GenBank中鹿前后盤吸蟲(KT198987)同源性最高，分別為98.2%和97.7%。遺傳進化分析表明，3株前后盤吸蟲梅花鹿源分離株與鹿前后盤吸蟲位于同一分支。表明，分離的蟲株在形態(tài)學和遺傳進化分析上均與鹿前后盤吸蟲具有高度的一致性，提示獲得的前后盤吸蟲梅花鹿源分離株為鹿前后盤吸蟲。

鹿前后盤吸蟲；形態(tài)； pcox1； pnad1；遺傳進化分析

前后盤吸蟲病(Paramphistomosis)是由前后盤科(Paramphistomidae)吸蟲所引起的寄生性吸蟲病，是近年來被認為嚴重影響反芻動物生產性能的主要疾病之一[1]。前后盤吸蟲種類繁多，呈世界性分布，以熱帶、亞熱帶地區(qū)流行率較高[2]，不同地區(qū)感染的前后盤吸蟲種類不同，其中以鹿前后盤吸蟲(Paramphistomumcervi)最為常見[3]。鹿前后盤吸蟲成蟲寄生于牛、水牛、綿羊、山羊以及野生反芻動物的瘤胃和網胃中，引起的臨床癥狀與寄生數量有密切關系；當大量的童蟲在移行過程中寄生于皺胃、小腸、膽管時，可引起嚴重的胃腸炎，尤其是幼齡動物的感染率和死亡率都較高[4]。雖然目前還不清楚臨床誤診和亞臨床癥狀的動物數量，但感染的動物均出現飼料轉化率降低、體質量減輕、泌乳量下降，據此估計該病所造成的經濟損失遠高于其他體內蠕蟲[5-6]。

前后盤吸蟲病的診斷主要依據病史和臨床癥狀，確診需要進行蟲卵或蟲體的形態(tài)學鑒定[2,7]，而早期診斷可促使牧場及時采取防治措施從而減輕膽管、瘤胃的損傷。由于多數前后盤吸蟲形態(tài)相近，目前尚缺乏可靠的區(qū)別鑒定方法。糞檢時，鹿前后盤吸蟲蟲卵與其他吸蟲卵相似，易出現誤診，且輕微感染和亞臨床感染時檢測更不敏感，因此，使用該診斷方法亦會延誤病情。血清學診斷可用來彌補形態(tài)學鑒定的不足，部分蟲體、分泌排泄抗原可被感染動物的血清識別，認為可將其作為診斷抗原用于臨床疫情監(jiān)測[8-9]，但目前還尚未在臨床推廣使用。

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，PCR、PCR-RFLP、DNA技術為寄生蟲病診斷、病原分類、遺傳變異研究提供有效手段。線粒體DNA(mtDNA)是獨立于細胞核染色體的基因組，其結構簡單、母系遺傳、無重組、進化速率快，在種間、種內、群體間和群體內具有廣泛的多態(tài)性，已被廣泛用于寄生蟲分類鑒定、群體遺傳、系統(tǒng)進化研究中[10]。目前，用于吸蟲發(fā)育分析的主要基因包括細胞色素c氧化酶第1亞基( cox1)基因、NADH脫氫酶( nad1)基因、內轉錄間隔區(qū)(ITS)等[11-14]。本研究以溫州地區(qū)梅花鹿體內分離的前后盤吸蟲蟲體為研究對象，對其進行形態(tài)學種類鑒定和線粒體( cox1和 nad1)基因的擴增及序列分析，以期為鹿前后盤吸蟲的分類鑒定提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和蟲體

加拿大樹膠、DNA提取試劑盒TIAN Namp Genomic DNA Kit購自天根生化科技(北京)有限公司，TaqDNA聚合酶、瓊脂糖、DL2000 DNA Marker購自寶生生物工程(大連)有限公司。蘇木素染液，實驗室配制保存。所用蟲體均采自溫州某鹿場急性死亡后的3只梅花鹿，剖檢發(fā)現瘤胃內有大量蟲體，采集蟲體并保存于φ=75%的酒精中，備用。

1.2 蟲體形態(tài)學鑒定

將固定于φ=75%酒精中的前后盤吸蟲取出，置于乳酸透明液透明2 d；將配好的蘇木素染液用蒸餾水稀釋10倍，將透明的蟲體標本投入染色液中染色過夜；蟲體染色完畢后用蒸餾水洗去浮色，依次投入φ=30%、50%、70%的梯度酒精中各脫水30 min；將蟲體標本置于2 個載玻片之間，載玻片兩端用適當厚度的紙片墊襯以防止壓片過薄損傷蟲體組織，再用橡皮筋扎緊兩端之后投入φ=70%的酒精固定24 h；次日用鹽酸酒精混合液(φ=80%的酒精100 mL加入2 mL濃鹽酸)分色30 min，使外部濃色退去，內部著色良好即可；分色后的蟲體依次投入φ=80%、90%、95%、100%的梯度酒精中各脫水1 h；脫水完畢后將蟲體投入二甲苯中30 min，蟲體完全透明后取出；將透明后的蟲體置于載玻片上，滴加適量的中性樹膠后用蓋玻片封片，干后置于顯微鏡下觀察并采集圖像，參照文獻[15]的方法鑒定其種類。

1.3 蟲體基因組DNA的提取

將保存于φ=75%酒精中的蟲體用生理鹽水洗滌3次，剪取1/2蟲體置于1.5 mL離心管中，用研磨棒充分研磨20 min，加入200 μL 的GA溶液和20 μL 蛋白酶K，渦旋震蕩使其徹底混勻，將其置于56 ℃水浴鍋中消化過夜，期間顛倒混勻6次直至消化完全，次日按照DNA提取試劑盒說明書進行操作，提取的DNA樣品保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.4 cox1基因和 nad1基因的PCR擴增

參照Bowles等[16]報道的JB3、JB4.5、JB11、JB12引物用于擴增線粒體 cox1基因部分序列( pcox1)和 nad1基因部分序列( pnad1)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。 pcox1和 pnad1預期擴增片段大小分別為450和500 bp。

表1 擴增 pcox1和 pnad1基因片段的引物序列

PCR反應體系為25 μL：蒸餾水14.375 μL，10× PCR buffer 2.5 μL，MgCl23 μL，dNTP 2 μL，Primer(100 pmol/μL) 2 μL(上下游各1 μL)，Taqpolymerase(5 U/μL) 0.125 μL，模板DNA 1 μL。反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃(55 ℃)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL的PCR產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，電泳結束后通過凝膠成像系統(tǒng)攝像并記錄結果。

1.5 序列分析與種系發(fā)育分析

將PCR產物直接送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果首先與GenBank中的序列進行Blast比對分析，確認數據可用性。使用ClustalX1.83軟件、Chromas軟件及圖譜對正向、反向序列進行拼接和人工修正。從GenBank中檢索現有前后盤吸蟲 cox1和 nad1序列(登錄號為KT198987、KP341657和KM397348)，利用DNAstar 5.0 中的Megalign程序進行相似性分析并計算種間及種內差異。利用ClustalX 1.83及Mega 5.0軟件對3個前后盤吸蟲的鹿源分離株 pcox1和 pnad1序列與GenBank上收錄的代表性吸蟲的序列進行比對及計算遺傳距離，然后用最大似然法(ML)進行遺傳進化樹狀圖分析。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

新鮮蟲體為鮮紅色，呈圓錐形，蟲體略向腹面彎曲，大小約為(5 ～8 )mm×(3 ～4)mm，寄生于梅花鹿瘤胃內。染色后蟲體內部結構清晰可見(圖1)?？谖P位于蟲體前端，腹吸盤則位于蟲體亞末端，口、腹吸盤大小比例約為1∶4。缺咽，2條腸支較長，經3 ～ 4個彎曲，直達腹吸盤邊緣。卵黃腺發(fā)達，濾泡狀，位于腸支兩側。睪丸2個，呈橫橢圓形，前后排列于蟲體中后部。卵巢圓形，位于睪丸后側緣。子宮在睪丸后緣經數個彎曲，沿睪丸背緣上升，至前睪前緣。子宮內充滿蟲卵。從蟲體形態(tài)結構特征判斷，該吸蟲初步鑒定為鹿前后盤吸蟲(P.cervi)。

2.2 PCR擴增

對 3株鹿前后盤吸蟲樣品的 pcox1基因和 pnad1基因片段進行PCR，成功擴增出約450和500 bp的片段，與預期的目的片段大小相符，且未出現非特異性條帶，空白對照為陰性(圖2)。

2.3 測 序

pcox1和 pnad1基因陽性樣品經測序后，應用軟件對正、反序列進行拼接并輔以人工核對。結果 pcox1和 pnad1核苷酸序列分別為446和505 bp。通過核苷酸序列比較，3個樣品測序結果完全一致。經DNAStar 5.0中的Megalign軟件分析表明， pcox1和 pnad1基因A、T含量分別為63%和63.5%。

a.前吸盤 Anterior sucker；b.腸支 Cecal bifurcation； c.卵黃腺 Vitelline gland； d.睪丸 Testis； e.腹吸盤 Posterior suker； f.卵巢 Ovary； g.子宮 Uterus

M. DNA Marker DL2000；1.陰性對照 Negative control；2～4.前后盤吸蟲WZ1、WZ2、WZ3 Samples of P.cervi(WZ1, WZ2 and WZ3)

將樣品的 pcox1和 pnad1基因序列與 GenBank收錄的相應前后盤吸蟲序列[鹿前后盤吸蟲(KT198987)、雷登前后盤吸蟲(KP341657)、長菲策吸蟲(KM397348)]和其他吸蟲序列[似錐低頸吸蟲(KM111525)、肝片吸蟲(AF216697)、大片吸蟲(NC_024025)、土耳其斯坦血吸蟲(HQ283100)]進行比對分析。序列經Clustal X 1.83軟件比對和DNAStar 5.0中的Megalign 軟件分析，鹿前后盤吸蟲溫州分離株 pcox1核苷酸序列與GenBank公布的鹿前后盤吸蟲的種內差異為0～1.8%，序列相似性為98.2%；而與同科的雷登前后盤吸蟲和長菲策吸蟲種間存在較大的差異，種間差異為14.4%～15.2%，序列相似性小于87%。 pnad1核苷酸序列與GenBank收錄的鹿前后盤吸蟲的種內差異為0～2.3%，序列相似性為97.7%；與同科的其他2種吸蟲種間差異為13.8%～18.1%，序列相似性小于87%。鹿前后盤吸蟲 pcox1和 pnad1基因序列與其他所屬吸蟲相比，序列相似性均較低。

2.4 pcox1和 pnad1的種系發(fā)育分析

應用Mega 5.0軟件，將擴增的 pcox1和 pnad1目的基因序列與GenBank上收錄的鹿前后盤吸蟲(KT198987)、雷登前后盤吸蟲(KP341657)、長菲策吸蟲(KM397348)及其他吸蟲的線粒體基因組序列，并以土耳其斯坦血吸蟲(HQ283100)作為外群共同構建系統(tǒng)遺傳進化樹。3個鹿前后盤吸蟲溫州分離株位于同一分支上，與P.cervi合為姐妹支。雷登同盤吸蟲與長菲策吸蟲聚類在另一分支，與鹿前后盤吸蟲和鹿前后盤吸蟲溫州分離株合為一大支。結果表明，鹿前后盤吸蟲溫州分離株與其他2個前后盤科吸蟲距離較遠，與其他所屬吸蟲分離更遠(圖3)。

圖3 基于 pcox1和 pnad1基因序列構建的進化樹

3 討 論

前后盤吸蟲隸屬于扁形動物門(Platyhelminthes)吸蟲綱(Trematoda)復殖目(Digenea)，包含6個科200多個種。調查發(fā)現，中國牛羊感染的前后盤吸蟲種類達80多個[17]。前后盤吸蟲種類的鑒定主要依據蟲體形態(tài)大小、前后吸盤及生殖孔的位置、睪丸形狀及位置、卵巢形態(tài)及位置、卵黃腺等特征。本試驗前后盤吸蟲溫州分離株的蟲體染色結構與Choudhary等[7]描述的蟲體形態(tài)基本一致。但有研究[18]表明，前后盤吸蟲不同發(fā)育階段蟲體的形態(tài)和內部器官差異較大，染色過程即費時又費力，且因該蟲體較厚，染色后蟲體內部結構不明顯，同時需要熟練的寄生蟲學專家才能區(qū)分鑒別其種類，因此，僅通過形態(tài)學方法準確鑒定前后盤吸蟲種類還存在一定的困難。

PCR技術結合測序能精確區(qū)分生物種群的遺傳進化程度，已廣泛應用于病原的遺傳變異、分子分類和種系發(fā)育分析中。線粒體DNA一般為雙鏈閉環(huán)狀，編碼的蛋白為細胞內呼吸鏈中的酶復合體組分。相較于核糖體DNA，mtDNA進化速率快，能較好反映物種的群體內、群體間、種間和種內遺傳變異情況，是研究進化的理想工具。其中，線粒體基因進化過程中編碼蛋白質的核苷酸序列比較保守，因此， cox1和 nad1基因可作為分子標記應用于吸蟲種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。李利等[13]以 pcox1和 pnad1基因片段研究4種不同宿主來源土耳其斯坦東畢吸蟲的遺傳變異情況顯示，線粒體基因存在差異。董世娟等[19]以 pcox1基因、黃維義等[20]以 pnad1基因片段研究中國片形吸蟲的遺傳變異情況顯示， pcox1和 pnad1序列種內變異不明顯，而種間變異顯著，可作為片形吸蟲分類鑒定的遺傳標記。

本研究中所獲得的3個前后盤吸蟲梅花鹿源分離株樣品mtDNA的 pcox1和 pnad1基因在堿基片段長度上無差異，表明這2個基因序列比較保守。前后盤吸蟲梅花鹿源分離株與GenBank中的鹿前后盤吸蟲P.cervi的相似度均在97%以上，而與其他種類吸蟲相比，相似性低于87%。3個梅花鹿源分離株 pcox1基因序列的種間差異(14.4%～15.2%)遠大于種內差異(0～1.8%)； pnad1基因序列種間差異(13.8%～18.1%)比種內差異(0～2.3%)大，說明 pcox1和 pnad1可為種間差異提供遺傳標記，適用于鹿前后盤吸蟲的鑒定。這一結論與Ghatani對印度多種前后盤吸蟲的 pcox1基因序列分析一致[12]。采用ML構建的進化樹顯示，前后盤吸蟲溫州分離株與P.cervi位于同一分支，同源性最高，其所屬分支與其他吸蟲所屬分支較遠，進一步說明 cox1和 nad1可作為理想的遺傳標記用于寄生蟲分類和進化研究中[21]，為寄生蟲的種類鑒定和分子流行病學研究提供有力工具。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Identification and Phylogenetic Analysis ofParamphistomumcervifromCervusnippon

JIAN Yongli1, TU Yiqiang1, GAO Yong’an1and SONG Junke2

(1. Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou Zhejiang 325006, China; 2. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

The aim of the present study was to identify and genetically analyzeParamphistomumsp. collected from Cervus nippon around Wenzhou region of Zhejiang province in China. Adult worms were identified based on morphological observation under microscopy after staining, and then the pcox1 and pnad1 genes were analyzed by PCR and sequencing. Morphological identification results showed thatParamphistomumsp. fromC.nipponwere close toP.cerviin external shape, size and internal organs. Comparative sequence analysis demonstrated that the pcox1 and pnad1 sequences from threeC.nippon-derivedParamphistomumsp. were 446 bp and 505 bp in length and entirely consistent in similarity. Moreover, the homologies were the highest between isolates fromC.nipponandP.cervi(KT198987) in GenBank, reached 98.2% and 97.7%, respectively. Phylogenetic analysis revealed that the threeParamphistomumsamples fromC.nipponand theP.cervi(KT198987) locate in the same branch. These results indicated that theParamphistomumsp. has high consistency withP.cerviin morphology and phylogenetic analysis, suggesting theParamphistomumsp. sampled from theC.nipponin Wenzhou area isP.cervi.

Paramphistomumcervi；Morphology; pcox1; pnad1; Phylogenetic analysis

JIAN Yongli, female, lecture.Research area: prevention and control of the zoonotic parasitic diseases. E-mail:wkyjianyl@163.com

SONG Junke, male, lecture. Research area: research and teaching work of animal parasitic diseases. E-mail:sjk7998@163.com

日期：2017-05-22

2016-06-28

2016-09-06

浙江省教育廳科研項目(Y201432069)。

簡永利，女，講師，從事人獸共患寄生蟲病防控研究。E-mail:wkyjianyl@163.com

宋軍科，男，講師，主要從事動物寄生蟲病的研究。E-mail: sjk7998@163.com

S852.73

A

1004-1389(2017)05-0665-06

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0856.006.html

Received 2016-06-28 Returned 2016-09-06

Foundation item Education Department Scientific Research Item of Zhejiang Province(No.Y201432069).