光照對大豆葉片衰老相關(guān)基因差異表達(dá)的影響

張紅梅，董俊彤，劉斌，蘭小茜，李宏宇

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所）

光照對大豆葉片衰老相關(guān)基因差異表達(dá)的影響

張紅梅1，董俊彤1，劉斌2，蘭小茜1，李宏宇2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所）

利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析不同光照條件下大豆墾農(nóng)18（KN18）葉片衰老相關(guān)基因（GmWRKY53b、GmCIB1、GmPAO1、GmSAG12）及藍(lán)光受體隱花色素基因（GmCRY2a）的表達(dá)情況。結(jié)果表明：GmWRKY53b、GmCRY2a在長光照（LD）條件下比在短光照（SD）條件下的表達(dá)量高；GmCIB1在長光照條件下比在短光照條件下的表達(dá)量低；長光照條件下GmSAG12的基因的表達(dá)量先高于短光照條件下的表達(dá)量，光照16 h時GmSAG12在長光照條件下的表達(dá)量低于短光照條件下的表達(dá)量；而GmPAO1基因在不同光周期處理表達(dá)量沒有明顯差異。

光周期；基因差異表達(dá)；大豆

葉片衰老作為植物一個重要的生命特征，是程序性細(xì)胞死亡（PCD）的一種，并受諸多環(huán)境因素影響，有研究顯示光也參與到此調(diào)控中[1]。鑒于衰老在植物生長發(fā)育過程中的重要性，國內(nèi)外已經(jīng)相繼開展了廣泛研究。擬南芥葉片衰老機(jī)制已得到深入全面的研究，結(jié)果顯示是一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)控子相互作用而程序性調(diào)控的結(jié)果，如葉片衰老相關(guān)基因WRKY53的活性及表達(dá)受植物激素和環(huán)境的共同調(diào)控[2-3]。而光作為植物生長的主要環(huán)境因子，其如何調(diào)控葉片衰老目前尚未清楚。有研究報道，光、庇蔭以及黑暗均能促進(jìn)擬南芥的葉片衰老，這暗示了光調(diào)控的葉片衰老是一個復(fù)雜的過程[4-7]。盡管如此，由于葉片衰老調(diào)控受諸多環(huán)境因素誘導(dǎo)及生長發(fā)育時期復(fù)雜的內(nèi)外因素相互作用，目前對其作用機(jī)理的認(rèn)識仍非常有限。光照與葉片衰老有密切關(guān)系，然而光環(huán)境如何影響葉片衰老還不清楚。目前對大豆葉片衰老分子機(jī)制的了解更是知之甚少。

大豆是全球范圍內(nèi)的一種重要經(jīng)濟(jì)作物。我國大豆種植常受外界環(huán)境因子如日照、高溫、干旱等逆境因子的影響而發(fā)生早衰，最終導(dǎo)致減產(chǎn)。早期已有實(shí)驗(yàn)證明，減緩種子發(fā)育過程中植株的衰老可以有效地提高大豆的品質(zhì)和產(chǎn)量[8-9]。研究選取光誘導(dǎo)葉片衰老相關(guān)基因利用實(shí)時熒光定量PCR方法分析不同光周期影響下GmWRKY53b、GmCIB1、GmSAG12、GmPAO1和GmCRY2a基因在大豆KN18中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化，擬探索光周期對調(diào)控大豆葉片衰老影響的分子機(jī)制。大豆衰老調(diào)控機(jī)制的揭示，有助于防止大豆早衰，有效保證大豆的產(chǎn)量，具有重大的實(shí)用價值和經(jīng)濟(jì)效益，并為改良大豆葉片衰老相關(guān)性狀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大豆品種：墾農(nóng)18，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所劉斌實(shí)驗(yàn)室提供和保存。

RNA提取試劑TRNzol購于Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix kit購于Transgen公司，SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）購于TaKaRa公司。三氯甲烷、異丙醇、乙醇等均購于國內(nèi)生化試劑公司。

小型臺式高速冷凍離心機(jī)、Roche480實(shí)時熒光定量基因擴(kuò)增儀、ND2000 NanoDrop分光光度計(jì)、HR350 HiPoint光譜儀、電泳儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植株培養(yǎng)條件

選取飽滿、大小一致的大豆種子，種植于溫室，培養(yǎng)條件為：長光照（16 h光照/8 h黑暗）或短光照（8 h光照/16 h黑暗），光照強(qiáng)度為250（μmol·m-2）·s-1，培養(yǎng)溫度為25℃。

大豆墾農(nóng)18（KN18）種植于長光照LD（16 h光照/8 h黑暗）和短光照SD（short day）（8 h光照/16 h黑暗）條件下，當(dāng)子葉剛展開時每間隔4 h取樣，各取7個時間點(diǎn)（24 h），樣品用液氮冷凍后貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA實(shí)驗(yàn)

利用于Invitrogen公司TRIzol試劑盒提取大豆葉片的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，用于實(shí)時熒光定量PCR的模板。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)基因的CDS序列，Real-time引物利用Primer Premier 5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物合成由華大基因完成，PAGE純化。

表1 引物設(shè)計(jì)表Table 1Primer design

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）

實(shí)時熒光定量PCR采用Light Cycler 480 SYBR Green I Master system進(jìn)行，利用SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）檢測熒光信號。以稀釋100倍的cDNA為模板，大豆TIP41基因作為對照進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)2-ΔΔCT[7]計(jì)算基因相對表達(dá)變化倍數(shù)。為確保Ct值一致性，包括對照基因在內(nèi)的每個樣品均設(shè)置3次重復(fù)。在15 μL的反應(yīng)體系中，2× SYBR Permix Ex Taq 7.5 μL，上、下游引物各0.3 μL，模板cDNA 5 μL，ddH2O 1.7 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 sec，95℃變性5 sec，60℃20 sec，40 cycles。溶解曲線：95℃10 sec，65℃1 min，95℃15 sec。

2 結(jié)果與分析

2.1 光周期對大豆GmWRKY53b表達(dá)影響

GmWRKY53b在不同光周期條件下的表達(dá)情況分析顯示（圖1）。長光照LD條件下的GmWRKY53b表達(dá)量均明顯高于短光照SD條件下的表達(dá)量，LD條件下和SD條件下GmWRKY53b表達(dá)量0至4 h都呈上升趨勢，4 h后呈表達(dá)量下降；培養(yǎng)8 h后，LD條件下GmWRKY53b表達(dá)量呈上升趨勢，16 h達(dá)最大表達(dá)量；而SD條件下GmWRKY53b表達(dá)量呈下降趨勢，LD條件下GmWRKY53b表達(dá)量明顯高于SD條件下表達(dá)量，經(jīng)T檢驗(yàn)分析P＜0.05差異顯著，與我們前期表型試驗(yàn)結(jié)果LD條件下促進(jìn)KN18葉片衰老相符。結(jié)果表明，GmWRKY53b可能與長光照下的葉片衰老呈正相關(guān)。

圖1 光周期對大豆GmWRKY53b表達(dá)影響Fig.1Effect of Light on GmWRKY53b expression

2.2 光周期對大豆GmCRY2a表達(dá)影響

KN18大豆品種中GmCRY2a的表達(dá)量在LD條件下均高于SD條件（圖2）。LD條件下，GmCRY2a表達(dá)量0至4 h呈上升趨勢，GmCRY2a表達(dá)量達(dá)最高；培養(yǎng)4 h后，GmCRY2a表達(dá)量呈下降趨勢，至8 h表達(dá)量最低，8 h后GmCRY2a表達(dá)量出現(xiàn)上升趨勢；SD條件下0至4 h GmCRY2a表達(dá)量呈緩慢上升，4 h呈下降至12 h達(dá)表達(dá)量最低，后又上升趨勢。LD條件下GmCRY2a表達(dá)量明顯高于SD條件下表達(dá)量，經(jīng)T檢驗(yàn)分析P＜0.05差異顯著。結(jié)果表明，GmCRY2a可能與長光照下的葉片衰老呈正相關(guān)。

圖2 光周期對大豆GmCRY2a表達(dá)影響Fig.2Effect of light on GMCRY2a expression

2.3 光周期對大豆GmCIB1表達(dá)影響

由圖3可以看出，GmCIB1的表達(dá)與GmWRKY-53b、GmCRY2a基因的表達(dá)不同，在LD生長條件下的KN18中表達(dá)量明顯低于SD條件下的表達(dá)量。LD條件下，GmCIB1表達(dá)量呈下降趨勢至16 h。SD條件下0至8 h GmCIB1呈上升趨勢，8 h達(dá)最大表達(dá)量，8 h后呈下降趨勢至16 h。16 h后，LD條件下和SD條件下GmCIB1的表達(dá)量變化趨勢一致，但與LD條件相比，SD條件下的GmCIB1的表達(dá)量高于LD條件的表達(dá)量。研究表明，GmCIB1可能與長光照下的葉片衰老負(fù)相關(guān)調(diào)控。

圖3 光周期對大豆GmCIB1表達(dá)影響Fig.3Effect of light on GMCIB1 expression

2.4 光周期對大豆GmPAO1表達(dá)影響

由圖4可以看出，GmPAO1在KN18中LD條件下的表達(dá)量與SD條件下的表達(dá)量無明顯差異。在后期，LD條件下GmPAO1的表達(dá)量明顯高于SD條件的表達(dá)量。

圖4 光周期對大豆GmPAO1表達(dá)影響Fig.4Effect of light on GmPAO1 expression

2.5 光周期對大豆GmSAG12表達(dá)影響

不同光周期條件下GmSAG12表達(dá)情況顯示（圖5），LD生長條件下KN18中GmSAG12的表達(dá)變化表現(xiàn)為LD條件下的該基因的表達(dá)量先高于SD條件下的表達(dá)量，光照16 h時GmSAG12在LD條件下的表達(dá)量低于SD條件下的表達(dá)量。研究結(jié)果表明GmSAG12有可能是光周期調(diào)控的葉片衰老基因。

圖5 光周期對大豆GmSAG12表達(dá)影響Fig.5Effect of light on GmSAG12 expression

3 討論

衰老作為葉片發(fā)育的最終階段，是程序性細(xì)胞死亡（PCD）的一種，并受諸多環(huán)境因素誘導(dǎo)，以及生長發(fā)育時期復(fù)雜的內(nèi)外因素相互作用的影響[9]。與其他PCD不同的是，葉片衰老是一個有許多生理變化和分子事件組成的連續(xù)的過程。植物中大量的基因表達(dá)為節(jié)律模式。比如，擬南芥中90%的基因已經(jīng)被證實(shí)在晝夜循環(huán)條件下動態(tài)表達(dá)[10]。

在WRKY家族中，WRKY53與葉片衰老相關(guān)的功能被深入研究，且在葉片衰老過程中表達(dá)量升高[11-12]。 WRKY53是一個主要的衰老正調(diào)節(jié)子，通過表達(dá)WRKY53的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出早衰表型，WRKY53敲除突變體的衰老明顯被延緩[3]。研究表明，WRKY53在葉片衰老早期起調(diào)控作用，其表達(dá)量在葉片衰老早期上升但在后期下降，暗示了WRKY53在衰老起始階段起到關(guān)鍵性作用[13]。

PAO是葉綠素降解代謝過程中的關(guān)鍵酶。研究表明，PAO mRNA和PAO蛋白在衰老葉片中的含量增加[14]。PAO酶的活性與葉綠素降解速率成正相關(guān)。在長光照條件下，cry2突變體表現(xiàn)出晚花表型；在短光照條件下，cry2突變體的開花時間不受影響，研究表明隱花色素CRY2參與了光周期控制的開花途徑的調(diào)控[15]。在擬南芥中，SAG12是一個僅隨葉齡的增加而表達(dá)上調(diào)的基因，其表達(dá)不受植物激素或外界環(huán)境因素影響[16]，因此SAG12一直被認(rèn)為是葉齡依賴的衰老標(biāo)志基因。GmCIB1蛋白為bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，轉(zhuǎn)基因植株表型分析顯示，GmCIB1促進(jìn)植物衰老[17]。

前期我們研究不同光周期對大豆葉片衰老影響的結(jié)果顯示，與短光照條件相比，長光照條件下生長的KN18表現(xiàn)出明顯的早衰表型，暗示了長光照可能促進(jìn)大豆葉片衰老。為探索光周期對大豆葉片衰老相關(guān)基因的表達(dá)，我們利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析不同光照條件下葉片衰老過程中衰老相關(guān)基因GmWRKY53b、GmCIB1、GmPAO、GmSAG12以及藍(lán)光受體GmCRY2a在大豆葉片的表達(dá)量。結(jié)果表明，GmWRKY53b、GmCRY2a可能與長光照條件下葉片早衰正相關(guān)；GmCIB1可能與長光照條件下葉片早衰負(fù)相關(guān)，；LD生長條件下KN18中GmSAG12的表達(dá)變化表現(xiàn)為LD條件下的該基因的表達(dá)量先高于SD條件下的表達(dá)量，光照16 h時GmSAG12在LD條件下的表達(dá)量低于SD條件下的表達(dá)量。研究結(jié)果表明暗示了GmSAG12有可能是光周期調(diào)控的葉片衰老基因；而GmPAO基因在不同光周期處理表達(dá)量沒有明顯差異。研究結(jié)果為后續(xù)研究GmWRKY53b、GmCIB1、GmCRY2a、GmSAG12基因在光周期調(diào)控葉片衰老的功能奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Light on Soybean Leaf Senescence-associated Genes Difference Expression

Zhang Hongmei1，Dong Juntong1，Liu Bin2，Lan Xiaoxi1，Li Hongyu2
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2．Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences）

The dynamic expression profiles of the senescence-associated genes（GmWRKY53b，GmCIB1，GmPAO1，GmSAG12）and blue light receptors GmCRY2a expression profiles of Soybean（Glycine max L.）KN18 were analyzed under different light conditions by quantitative real-time PCR（qPCR）.The results indicated that GmWRKY53b and GmCRY2a expression levels were higher in long day（LD）than in short day（SD），GmCIB1 expression levels was lower in LD than in SD.GmSAG12 expression levels was higher in LD than in SD，but GmSAG12 expression levels at 16 h was lower in LD than in SD，while GmPAO1 expressed in different photoperiod treatment had no significant difference.

photoperiod；genes difference expression；soybean

S565.1

A

1002-2090（2017）03-0077-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.017

2016-06-28

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士啟動基金（XDB2012-14）。

張紅梅（1969-），女，副教授，吉林大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事植物生物技術(shù)方面的研究工作。

李宏宇，女，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：lihongyu@caas.net。