韓榮勛,羅靜波,俞海東

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

巴氏消毒牛奶與羊奶粉中主要蛋白質(zhì)組成的 SDS-PAGE比較

韓榮勛,羅靜波,俞海東

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

采用SDS-PAGE凝膠電泳方法對(duì)相同蛋白質(zhì)質(zhì)量和相同樣品體積的巴氏消毒牛奶和羊奶粉的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行分析，分離后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色得到巴氏消毒牛奶和羊奶的電泳圖譜，比較了巴氏消毒牛奶和羊奶中蛋白質(zhì)組成的差異。結(jié)果表明，在同等條件下，牛奶中的αs-酪蛋白和β-酪蛋白以及κ-酪蛋白含量均高于羊奶粉。

SDS-PAGE；巴氏消毒牛奶；羊奶粉；蛋白質(zhì)

近幾年乳制品已經(jīng)成為人們普遍使用的營(yíng)養(yǎng)品，特別是作為幼兒的輔食被廣泛使用。而巴氏消毒牛奶即鮮奶和羊奶粉以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)受到廣大消費(fèi)者的喜愛。目前人們可利用的奶類有牛奶、山羊奶、綿羊奶、水牛奶、馬奶等十多種，其中牛奶是人們利用最多的動(dòng)物乳，占乳制品消費(fèi)量的95%[1]。羊奶的產(chǎn)量雖然遠(yuǎn)低于牛奶，但是近年來(lái)隨著人們營(yíng)養(yǎng)意識(shí)的提高，山羊奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也受到人們普遍重視，使用山羊奶的人群呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，而且奶山羊養(yǎng)殖是發(fā)展中國(guó)家尋求乳品來(lái)源的有效途徑[2]。我國(guó)奶山羊近年來(lái)發(fā)展迅速，形成了較大規(guī)模，山羊奶產(chǎn)量已達(dá)鮮奶總產(chǎn)量的15%左右。奶粉制品中，山羊奶粉的比例連年保持在20%以上[3]。山羊奶和牛奶均含有豐富的小分子活性蛋白質(zhì)，包括乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白等，這些活性蛋白對(duì)于維持新生兒的免疫功能及生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，在西方已將山羊奶列為療效食品[4]。蛋白質(zhì)是乳中的主要含氮物質(zhì)，含量在2.8%～3.8%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有對(duì)熱不穩(wěn)定的乳白蛋白和乳球蛋白[5]。真蛋白由于其可較好地反映乳品的真實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因而真蛋白是乳品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要標(biāo)志之一[6～8]。

目前有關(guān)乳制品的研究多集中于牛奶中進(jìn)行摻假分辨[9～10]、牛奶中蛋白致敏作用[11]以及三聚氰胺檢測(cè)等方面，很少有對(duì)牛奶和羊奶的蛋白質(zhì)組成的研究[12]。對(duì)牛乳蛋白質(zhì)的研究國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道，但對(duì)山羊乳蛋白質(zhì)的研究報(bào)道較少，并且主要是從理化性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分等方面進(jìn)行研究，缺乏對(duì)牛羊乳蛋白質(zhì)組成的比較研究。為此，本研究分析了牛奶與羊奶粉的蛋白質(zhì)組成成分的差異，以為牛奶、牛奶粉與羊奶粉的分辨提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為消費(fèi)者選擇更易于消化吸收的乳制品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的收集與準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)樣品為從市場(chǎng)購(gòu)買的巴氏消毒牛奶和羊奶粉，羊奶粉在實(shí)驗(yàn)前按使用說明進(jìn)行溶解(1g溶于6mL蒸餾水)。得到的樣品在4℃、3000r/min條件下離心20min去除乳脂和不容物獲得脫脂乳，100μL脫脂乳樣品分別與等體積的裂解緩沖液(0.3%SDS、3%DTT、蛋白酶抑制劑和0.5mol/L Tris/HCl，pH8.0)充分混合后在低溫條件下對(duì)樣品進(jìn)行超聲波粉碎處理。超聲波粉碎處理后在室溫條件反應(yīng)1h后在4℃、12000r/min條件下離心20min去除沉淀物。離心后取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度后分裝成每管60μg樣品并保存于-70℃冰箱中。

1.2 SDS-PAGE

SDS-PAGE采用8%和15%分離膠[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40% Acry/Bis(29︰1)、蒸餾水、10% SDS、10% APS、TEMED]，采用同等蛋白質(zhì)含量與同等樣品體積的上樣方法，上樣順序?yàn)镸arker、60μg牛奶、60μg羊奶粉、24μL牛奶、24μL羊奶粉。在100V電壓條件下進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)所用Marker電泳后出現(xiàn)7條條帶，分子質(zhì)量分別為200、150、100、80、60、40ku。電泳結(jié)束后取出凝膠，經(jīng)超純水漂洗后將凝膠放入固定液[30%(v/v)甲醇、10%(v/v)醋酸]中固定1h后取出凝膠，放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色24h。染色結(jié)束后用脫色液(1%醋酸)脫色后進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：30μg牛奶；2：30μg羊奶粉；3：24μL牛奶、4：24μL羊奶粉圖1 8%分離膠分離所得羊奶粉及牛奶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：30μg牛奶；2：30μg羊奶粉；3：24μL牛奶；4：24μL羊奶粉圖2 15%的離膠分離所得牛奶及羊奶粉蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜

為觀察具體蛋白質(zhì)組成差異，本研究采用同等蛋白質(zhì)含量(60μg)與同等樣品體積(24μL)的上樣方法，并且2組樣品在同一塊分離膠上進(jìn)行電泳。8%和15%的分離膠上進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳所得的電泳圖譜分別見圖1和圖2。

從圖1可以看出：牛奶樣品在150～80ku附近有乳鐵蛋白、血清白蛋白及免疫球蛋白等3條條帶，而羊奶粉則在血清白蛋白附近只有1條條帶。2個(gè)樣品的蛋白質(zhì)大都集中在40ku以下部分。從圖2可以清楚地觀察到40ku以下部分分離成αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳球蛋白等6條條帶。從整體上看，牛奶和羊奶粉在αs-酪蛋白和β-酪蛋白表達(dá)上存在明顯差異，在同質(zhì)量的條件下，羊奶粉的κ-酪蛋白和β-酪蛋白表達(dá)量與牛奶相似，但是羊奶粉中αs-酪蛋白明顯少于牛奶。在同體積的條件下，羊奶粉中的κ-酪蛋白、β-酪蛋白和αs-酪蛋白表達(dá)量均低于牛奶。在同等蛋白質(zhì)質(zhì)量與同等樣品體積條件下，在高相對(duì)分子質(zhì)量部分出現(xiàn)的3條蛋白質(zhì)條帶在同等蛋白質(zhì)質(zhì)量條件下牛奶中的表達(dá)量高于羊奶粉，而在同體積條件下牛奶和羊奶粉中的表達(dá)量基本相似。

3 討論與結(jié)論

為了尋找2種乳制品的蛋白組成差異，本研究采用SDS-PAGE方法比較分析了羊奶粉和牛奶的主要蛋白質(zhì)組成，結(jié)果表明，在凝膠圖譜中兩者蛋白質(zhì)表達(dá)表現(xiàn)出顯著差異。在15%的凝膠所得的電泳圖譜中可以觀察到羊奶粉的主條帶均分布在中部，而且比較清晰，這與張歌等[13]的研究結(jié)果相似。因?yàn)楸狙芯克捎玫臉悠肥敲撝Ｄ膛c脫脂羊奶粉，與張歌等所用樣品相同，分析方法也均采用SDS-PAGE，因此結(jié)果比較相似。在本研究結(jié)果中只能看到乳中大量存在的免球蛋白、酪蛋白類和血清白蛋白，這可能是因?yàn)槔业鞍渍寂Ｄ痰鞍踪|(zhì)的大部分，在本研究沒有去除酪蛋白，這就造成樣品中酪蛋白占據(jù)大多數(shù)從而無(wú)法觀測(cè)到乳清中的低豐度蛋白質(zhì)的條帶。

李武祎等[14]通過酸凝性實(shí)驗(yàn)觀察到在37℃、pH4.0條件下，α-酪蛋白組分形成了顆粒較大的凝塊，而β-酪蛋白組分形成的是松軟的絮凝物。體外消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示β-酪蛋白組分的消化性要明顯好于α-酪蛋白組分和牛乳酸沉酪蛋白[14]。而郭本恒[15]和Li-Chan E等[16]的研究結(jié)果也表明牛乳中αs-酪蛋白的大量存在造成酪蛋白膠束粒子顆粒大，在胃中形成堅(jiān)硬的凝塊而難以消化。從本研究所得到的等體積和等蛋白質(zhì)質(zhì)量的牛奶和羊奶粉的蛋白質(zhì)凝膠圖譜中，可以清晰地看到酪蛋白類在牛奶中高于羊奶粉，而羊奶粉中的αs-酪蛋白和κ-酪蛋白表達(dá)顯著低于牛奶中的表達(dá)。由此可以看出，羊奶粉中因αs-酪蛋白的低含量更易于嬰幼兒的消化吸收。

本研究結(jié)果表明，牛奶和羊奶粉中酪蛋白的種類及其組成間的比例存在明顯的差異，通過圖譜的觀察可以清晰地分辨出羊奶粉和牛奶。通過此法建立健全乳制品的圖譜對(duì)于檢測(cè)乳制品摻假和以次充好也能起到一定的作用，同時(shí)能為人們選擇更容易消化吸收的乳制品提供線索。

[1]Park Y W,Haenlein G F W.Handbook of milk of non-bovine mammals [M].Oxford：Blackwell Publishing,2006:24～26.

[2]FAO.FAO Yearbook，Production 1997,v.51 [Z].FAO Statistics Series,1998.

[3]中國(guó)食品工業(yè)年鑒編委會(huì).中國(guó)食品工業(yè)年鑒[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985.

[4]大品牌為何不做羊乳制品 [J].北方牧業(yè)，2007，(5)：4.

[5]劉東紅,唐佳妮,呂元,等.乳品真蛋白——定義、分析方法、計(jì)價(jià)及影響因素 [J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2008,8(5):115～119.

[6]唐佳妮，呂元．國(guó)內(nèi)外乳品真蛋白檢測(cè)方法的進(jìn)展 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009，35(4)：119～123．

[7]陳靜，王玉英，王婷婷,等.生鮮牛乳真蛋白快速檢測(cè)方法 [J].中國(guó)乳品工業(yè),2012,38(11):50～52.

[8]金江玉，宋子明，史海瑩,等.真蛋白率在液態(tài)奶質(zhì)量鑒別中的應(yīng)用 [J].中國(guó)乳品工業(yè).2012,40(2):48～50.

[9]管方方.牛乳中摻假大豆蛋白的SDS-PAGE方法研究[D].上海：上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院,2015.

[10]侯麗英,朱黎娜,李嬋,等.牛奶中高分子質(zhì)量蛋白致敏作用的初步研究[J].天津醫(yī)藥,2014,42(11):1091～1093.

[11]周青青.牛奶中三聚氰胺的ELISA和可視化納米金快速檢測(cè)技術(shù)研究[D].北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2014.

[12]Raynal-Ljutovac K,Lagriffoul G,Paccard P,etal.Composition of goat and sheep milk products: An update [J].Small Ruminant Research,2008,79:57～72.

[13]張歌.牛乳和羊乳蛋白質(zhì)差異比較及檢測(cè)方法的研究[D].西安:陜西科技大學(xué),2013.

[14]李武祎,郭順堂,俞樹孝,等.酪蛋白組分分離技術(shù)及消化性測(cè)定[J].食品科學(xué),2005,26(7):70～73.

[15]郭本恒.乳品化學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,2001.

[16]Li-Chan E,Nakai S.Rennin Modification of Bovine Casein to Simulate Human Casein Composition: Effect on Acid Clotting and Hydrolysis by Pepsin[J].Canadian Institute of Food Science & Technology Journal,1988,21:200～208.

[編輯] 余文斌

2017-03-28

長(zhǎng)江大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(120/801200010129)。

韓榮勛(1979-)，男(朝鮮族)，講師，博士，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)及家畜繁殖學(xué)研究,hanrongxun@126.com。

TS201.2+1

A

1673-1409(2017)10-0061-03

[引著格式]韓榮勛,羅靜波,俞海東.巴氏消毒牛奶與羊奶粉中主要蛋白質(zhì)組成的SDS-PAGE比較[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(10)：61～63.